【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，具体地说，涉及一种nk细胞体外高效扩增方法及应用。
技术介绍
1、早在20世纪70年代，肿瘤免疫研究发现正常机体的淋巴细胞可以杀伤某些肿瘤细胞，并证实这些淋巴细胞的杀伤作用是天然的，无需有抗体存在或预先致敏，因此将其命名为自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)。nk细胞参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等一系列的机体免疫活动。它的主要作用机制为：①分泌穿孔素(perforin)、颗粒酶(granzyme)等具有细胞毒性的溶解性颗粒，诱导靶细胞凋亡；②表达肿瘤坏死因子，与相应受体结合诱导靶细胞凋亡；③分泌细胞因子(如γ-干扰素等)、生长因子(gm-csf)和趋化因子等，招募巨噬细胞、树突状细胞、t细胞等协同作用；④抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)；⑤肿瘤细胞免疫逃避，下调mhc i类分子表达，促进nk细胞活化。
2、近年来，nk细胞在肿瘤免疫治疗的研究中引起广泛关注，在自体和异体nk细胞过继免疫治疗以及基因修饰nk细胞免疫治疗中取得了一定疗效，具备良好的应用前景。一些nk细胞制备方法已经被转化成为临床级或者是cgmp级的标准制备过程(lapteva n,durettag,et al.large-scale ex vivo expansion and characterization of natural killercells for clinical applications.cytotherapy.2012oct；14(9):1131-43)。在这些制备方法
3、研究表明适合临床应用的nk细胞数量在5×106-1×108细胞数量/体重(kg)，而nk细胞仅占人外周血淋巴细胞总数的5-15％，脐带血中nk细胞比例占淋巴细胞的15％-30％，因此需要进行体外大量扩增培养。目前，体外扩增nk细胞的技术主要有三种：一是采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养单个核细胞中的nk细胞；二是磁珠分选法，从单个核细胞纯化得到nk细胞，进行体外扩增；三是利用单纯的细胞因子组合从单个核细胞中激活和扩增nk细胞。饲养层细胞培养法可以获得大量高纯度的nk细胞，但引入了肿瘤细胞，存在一定风险；磁珠分选法可以快速的获得少量nk细胞，成本高，操作复杂；现有的细胞因子组合刺激单个核细胞中nk细胞的扩增的方法使nk细胞扩增倍数1000倍左右，nk细胞纯度在60％-90％，且数量和纯度上都无法满足治疗性的要求。
4、另外，还有很多文献报道体外扩增nk细胞的扩增方法，如：
5、cn112391344b公开了一种无包被nk细胞体外扩增和培养方法，nk细胞扩增培养14天后，cd3-cd56+阳性率从初始的13.92％变为96.10％，收获约94亿个nk细胞。但存在如下缺陷：①第0天，nk细胞接种密度为1.25×106cells/ml，在诱导阶段nk细胞扩增能力较弱，接种密度过低影响细胞间信号传导。②激活nk细胞阶段，第0天加入较高浓度的il-2，容易激活t细胞扩增，影响nk细胞的纯度；③在扩增的整个阶段，均使用含有il-2和il-15的培养基进行补液，il-15成本较高，在后期大量扩增培养过程中使用成本较高。
6、cn106434554b提供了nk细胞的制备方法，采用包被的方式对nk细胞进行扩增。外周血来源nk细胞扩增结果：nk细胞培养14天后，cd3-cd56+阳性率从初始的2.36％变为91.2％，收获约56亿个nk细胞，效靶比20：1的nk细胞杀伤率>90％。但存在如下缺陷：①采用包被方式进行扩增，操作繁琐；②引入了十余种抗体和相关细胞因子等，ifn-γ、il-18和il-21用量较大，成本较高；③nk细胞激活阶段，第0d加入4000iu/ml的il-2，容易激活t细胞扩增，影响nk细胞的纯度；④nk细胞扩增阶段没有使用il-15，不利于nk细胞扩增倍数提升；⑤效靶比20：1的nk细胞的杀伤率为90％以上，杀伤效果不显著。
7、cn108676775b公开了一种体外扩增脐带血nk的方法，采用抗体包被的方式对脐带血nk细胞进行扩增。实施例3结果最好，nk细胞扩增培养15天后，cd3-cd56+阳性率为95.33％，收获约114亿个nk细胞，效靶比10：1杀伤效率91.65％。但该方法存在如下缺陷：①采用了抗体包被的方式激活nk细胞，流程复杂，且包被过程使用较大量的ifn-γ，成本较高；②nk细胞培养过程中il-2浓度一致，均为500iu/ml，激活阶段浓度较高容易影响nk细胞纯度，在后期浓度较低，影响nk细胞增殖；③扩增阶段，nk细胞大量增殖，导致细胞因子使用量增多，il-2、il-7、il-15和il-21用量较大，成本较高。尤其是il-21在激活和扩增阶段用量均较大，成本很高。
8、cn114736859b公开了一种脐带血nk细胞的培养液及培养方法，但存在如下缺陷：①考虑了cd34造血干细胞增殖步骤，通过添加stemregenin 1、il-3等促进增殖，再通过il-15、scf等细胞因子促进分化为nk细胞，方案设计比较繁琐；②高剂量的il-2会同时刺激t细胞和nk细胞的增殖，因此使用哈西奈德，来抑制t细胞和单核细胞的生长，但引入哈西奈德，增加成本；③前期使用免疫抑制作用的哈西奈德，在后期就需要使用胸腺五肽来消除免疫抑制反应，促进nk细胞增殖，增加成本；④引入13种因子，包括细胞因子、小分子和链球菌制剂等，ok432制剂使用量较大，且成本较高；⑤nk细胞杀伤效果不显著，效靶比20：1时杀伤率为90.35％。
9、目前，无论是外周血还是脐带血扩增nk细胞的方法，都存在着所需激活因子多、成本高、扩增效率不够高或杀伤效果不显著等缺陷。因此，在保证临床安全性的前提下，如何提高nk细胞体外增殖效率和杀伤活性，简化操作流程，降低成本，成为其临床应用中亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术针对目前nk细胞扩增方式复杂、nk细胞纯度低、收获nk细胞数量少、且存在安全风险等不足，提供了一种操作简单的nk细胞体外高效扩增方法。该方法成本低，无需分选，无需滋养层细胞，无需包被，就能扩增出nk细胞的方法，可显著提高nk细胞的数量和纯度，具有较强的杀伤活性，可用于过继免疫细胞治疗。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种nk细胞体外高效扩增方法，包括如下步骤：
4、s1、单个核细胞分离；
5、s2、灭活血浆；
6、s3、接种、激活nk细胞：
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种NK细胞体外高效扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基M2添加有IL-15、IL-18、IL-21和IL-2，IL-2的浓度为100～1000IU/ml。
3.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤S4的扩增NK细胞为：
4.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基M1中，CD16抗体的浓度为50～200ng/ml，HER2抗体的浓度为1～10μg/ml，IL-15的浓度为50～100ng/ml，IL-18的浓度为50～200ng/ml，IL-21的浓度为1～50ng/ml，IL-2的浓度为0～50IU/ml；
5.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基M2中，IL-15的浓度为20～100ng/ml，IL-18的浓度为20～100ng/ml，IL-21的浓度为1～20ng/ml，IL-2的浓度为100～1000IU/ml；
6.根据权利要求5所述的扩增方法，其特征在于，扩增培养基M3中，IL-2的浓度为500～2000
7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，扩增培养基M1中，IL-15的浓度为50～200ng/ml，IL-2的浓度为500～2000IU/ml；
8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，扩增培养基M2中，IL-15的浓度为50-200ng/ml，IL-2的浓度为500～2000IU/ml；
9.根据权利要求4-8任意一项所述的扩增方法，其特征在于，步骤S3.1中，种瓶时细胞接种密度为1.5～2.5×106cells/ml，优选2×106cells/ml。
10.一种权利要求1-9任意一项所述的扩增方法得到的NK细胞在制备过继细胞治疗药物、CAR-NK细胞治疗药物以及NK细胞扩增试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种nk细胞体外高效扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基m2添加有il-15、il-18、il-21和il-2，il-2的浓度为100～1000iu/ml。
3.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤s4的扩增nk细胞为：
4.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基m1中，cd16抗体的浓度为50～200ng/ml，her2抗体的浓度为1～10μg/ml，il-15的浓度为50～100ng/ml，il-18的浓度为50～200ng/ml，il-21的浓度为1～50ng/ml，il-2的浓度为0～50iu/ml；
5.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，激活培养基m2中，il-15的浓度为20～100ng/ml，il-18的浓度为20～100ng/ml，il-21的浓度为1～20ng/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建刚，王彦娜，韩倩，赵丽娜，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。