【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与腺相关病毒(adeno-associated virus：aav)具有结合性的蛋白和腺相关病毒(aav)的分析方法。更详细而言，本专利技术涉及与aav的结合活性提高的改良aav结合性蛋白和基于感染能力的强弱来分析试样所含的aav的方法。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)为分类在细小病毒科(parvoviridae)、依赖病毒属(dependovirus)中的非包膜病毒。aav外壳粒子由3种蛋白质(vp1、vp2和vp3)构成，约60个蛋白质分子以大约vp1：vp2：vp3＝1：1：10的比率混杂、聚集而形成了直径20nm至30nm的正二十面体形状。
2、自然界中的aav缺乏自主增殖能力，复制依赖于腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒。上述辅助病毒存在时，aav基因组在宿主细胞内被复制，形成包含aav基因组的完整的aav粒子，从宿主细胞释放出aav粒子。另一方面，上述辅助病毒不存在的情况下，aav基因组形成维持为游离体的状态或整合于宿主染色体的状态(潜伏状态)。
3、aav能够感染包括人在内的很多物种的细胞，也会感染血细胞、肌肉、神经细胞等终止了分化的非分裂细胞，由于对人没有致病性而无需担心副作用、病毒粒子的物理化学性稳定等，因此作为以先天性基因疾病的治疗为目的的基因导入用载体的利用价值备受瞩目。
4、有报道称，通过将aav中的特定位置的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基会使细胞感染能力的强弱产生差异(非专利文献1)。因此，在将aav用作基因导入用载体时，需要迅速且简便地分析上述感染能力的强
5、基因重组aav载体(以下也简单记作“aav载体”)的制造通常如下进行：将编码aav粒子形成所必需的要素的核酸导入至细胞，从而制作具有产生aav能力的细胞(以下也记作“aav产生细胞”)，培养该细胞使之表达aav粒子形成所必需的要素，从而进行。所制造的aav载体可以从aav产生细胞来回收纯化，由此可得到治疗用aav载体制剂。
6、作为从aav产生细胞回收纯化aav载体的方法，有使用包含不溶性载体和固定于该载体的aav结合性蛋白的吸附剂，并且基于与aav的结合亲和性的利用亲和色谱的方法，可以从共存有夹杂物的包含aav载体的溶液中回收纯化该载体。作为具体例，专利文献1中，通过使用包含kiaa0319l(uniprotno.q8iza0)的胞外区结构域1(pkd1)和结构域2(pkd2)，并且将这些结构域中的特定位置处的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基而提高了对热、酸和碱的稳定性的多肽来作为固定于不溶性载体的aav结合性蛋白(以下也简单地记作“配体蛋白”)，由此实现了aav载体的高纯度的纯化。
7、有报道称，通过将aav中的特定位置的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基会使细胞感染能力的强弱产生差异(非专利文献1)。因此，在将aav用作基因导入用载体时，需要迅速且简便分析上述感染能力的强弱差异。但是，以往的分析方法如非专利文献1也公开那样为使用培养细胞的方法，需要极大的时间和人力。
8、现有技术文献
9、专利文献
10、专利文献1：wo2021/106882号
11、非专利文献
12、非专利文献1：lochrie，m.a.，et al.，journal of virology，80(2)，821，2006
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、如上所述，wo2021/106882号中用作配体蛋白的腺相关病毒(aav)结合性蛋白相较于天然型(无氨基酸置换的aav结合性蛋白)而言对热、酸和碱的稳定性有所提高。另一方面，需要进一步提高对aav的结合活性。
3、另外，如上所述，将aav用作基因导入用载体时，需要迅速且简便分析上述感染能力的强弱差异。但是，以往的分析方法如lochrie，m.a.，et al.，journal of virology，80(2)，821，2006(非专利文献1)也公开那样为使用培养细胞的方法，需要极大的时间和人力。
4、因此，本专利技术的课题在于，提供与aav的结合活性提高的改良aav结合性蛋白以及提供基于感染能力的强弱来分析试样所含的腺相关病毒的方法。
5、用于解决问题的方案
6、本专利技术人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过将构成腺相关病毒(aav)结合性蛋白的氨基酸残基中的特定残基置换为其它氨基酸残基，从而与aav的结合活性提高，以及，通过使用包含不溶性载体和固定于该载体的aav结合性蛋白的吸附剂对试样所含的腺相关病毒(aav)进行分析，从而可以基于感染能力的强弱来分析aav，至此完成了本专利技术。
7、本申请专利技术包括以下的[1]至[14]的方式。
8、[1]一种腺相关病毒(aav)结合性蛋白，其选自以下的(i)至(iii)中的任意者：
9、(i)至少包含序列号1记载的氨基酸序列中的第312位的丝氨酸至第500位的天冬氨酸的氨基酸残基，其中，在该第312位至第500位的氨基酸残基中发生了以下的(1)至(5)中的至少任意1个氨基酸置换的aav结合性蛋白：
10、(1)序列号1的第330位的丙氨酸置换为缬氨酸
11、(2)序列号1的第330位的丙氨酸置换为半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意者
12、(3)序列号1的第331位的酪氨酸置换为半胱氨酸
13、(4)序列号1的第332位的缬氨酸置换为色氨酸或酪氨酸
14、(5)序列号1的第333位的亮氨酸置换为半胱氨酸；
15、(ii)至少包含序列号1记载的氨基酸序列中的第312位的丝氨酸至第500位的天冬氨酸的氨基酸残基，其中，在该第312位至第500位的氨基酸残基中发生了上述(1)至(5)中的至少任意1个氨基酸置换，进而除了上述(1)至(5)所示的氨基酸置换以外还发生了1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上，并且具有aav结合活性的aav结合性蛋白；
16、(iii)包含下述氨基酸序列并且具有aav结合活性的aav结合性蛋白，所述氨基酸序列为：相对于在序列号1记载的氨基酸序列中的第312位的丝氨酸至第500位的天冬氨酸的氨基酸序列中发生了上述(1)至(5)中的至少任意1个氨基酸置换而成的氨基酸序列整体具有70％以上的同源性，并且残留有上述至少任意1个氨基酸置换的氨基酸序列。
17、[2]根据[1]所述的aav结合性蛋白，其选自以下的(iv)至(vi)中的任意者：
18、(iv)至少包含序列号1记载的氨基酸序列中的第312位的丝氨酸至第500位的天冬氨酸的氨基酸残基，其中，在该第312位至第500位的氨基酸残基中至少发生了以下的(1)的氨基酸置换的aav结合性蛋白：
19、(1)序列号1的第330位的丙氨酸置换为缬氨酸；
20、(v)至少包含序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺相关病毒(AAV)结合性蛋白，其选自以下的(i)至(iii)中的任意者：
2.根据权利要求1所述的AAV结合性蛋白，其选自以下的(iv)至(vi)中的任意者：
3.根据权利要求1所述的AAV结合性蛋白，其还至少发生了以下所示的10个位置的氨基酸置换：
4.根据权利要求3所述的AAV结合性蛋白，其选自以下的(vii)至(ix)中的任意者：
5.根据权利要求3所述的AAV结合性蛋白，其还发生了以下的(I)至(LXXXVII)中的至少任意1个氨基酸置换：
6.根据权利要求5所述的AAV结合性蛋白，其选自以下的(x)至(xii)中的任意者：
7.一种多核苷酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的AAV结合性蛋白。
8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种转化体，其为用权利要求8所述的表达载体转化大肠杆菌而得到的。
10.一种AAV结合性蛋白的制造方法，其包括下述工序：通过培养权利要求9所述的转化体而表达AAV结合性蛋白的工序；和，从得到的培养物中回收所表
11.一种AAV吸附剂，其包含不溶性载体和固定于该载体的权利要求1至6中任一项所述的AAV结合性蛋白。
12.一种柱，其包含权利要求11所述的AAV吸附剂。
13.一种AAV的纯化方法，其包括下述工序：向权利要求12所述的柱中添加包含AAV的溶液，使该AAV吸附于所述吸附剂的工序；和，使用洗脱液来洗脱所述吸附剂所吸附的AAV的工序。
14.一种基于感染能力的强弱来分析试样所含的AAV的方法，其包括下述工序：向权利要求12所述的柱中添加包含AAV的试样，使该AAV吸附于所述吸附剂的工序；和，使用洗脱液来洗脱所述吸附剂所吸附的AAV的工序。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种腺相关病毒(aav)结合性蛋白，其选自以下的(i)至(iii)中的任意者：
2.根据权利要求1所述的aav结合性蛋白，其选自以下的(iv)至(vi)中的任意者：
3.根据权利要求1所述的aav结合性蛋白，其还至少发生了以下所示的10个位置的氨基酸置换：
4.根据权利要求3所述的aav结合性蛋白，其选自以下的(vii)至(ix)中的任意者：
5.根据权利要求3所述的aav结合性蛋白，其还发生了以下的(i)至(lxxxvii)中的至少任意1个氨基酸置换：
6.根据权利要求5所述的aav结合性蛋白，其选自以下的(x)至(xii)中的任意者：
7.一种多核苷酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的aav结合性蛋白。
8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种转化体，其为用权利要求8所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：栗原健人，渡边和哉，大村慧太，吉田浩平，牧野友理子，田中亨，
申请(专利权)人：东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：
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