【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，涉及一种患者自身来源的培养体系，涉及高保真度的类体内样天然微环境和免疫细胞的培养系统，涉及一种肿瘤活性指标和代谢指标的药敏终点检测方法。
技术介绍
1、恶性胸腹水是中晚期癌症患者常见并发症，且给患者带来巨大痛苦，临床抽取胸腹水为常见缓解治疗方法，而抽取的胸腹水大多直接丢弃。中晚期癌症患者往往不适合手术治疗，没有组织样本来源可用于体外药敏检测，组织穿刺也往往不能满足体外药敏检测需求。胸腹水含有大量的脱落恶性细胞，是体外培养药敏检测理想的原材料。基于患者来源恶性胸腹水体外培养的药敏检测技术一般存在两个方面问题，培养基成分昂贵，使用具有伦理问题；体外二维培养不能准确反应其原始生物学特征而无法准确预测体内肿瘤对抗癌药物的反应；现有的三维培养必须基于固态的基质胶或者一定的培养支架，除了成较高且限制终点检测选择外，而且与体内液态环境不符。在抗癌药物体外药物反应检测中，普遍采用药物浓度梯度法测定量效反应，均无与体内反应对标的cutoff值，可评价性不足。此外，现有药敏检测计数缺乏耐药和敏感的阳性对照物，可靠性低，无法在临床预测药物反应中进行应用；而现有的一些耐药和敏感药物细胞株均为二维贴壁培养基础上二维药物反应体系所构建，形成三维培养物之后，反应性发生改变，大多丧失敏感性，无法运用于三维培养评价体系。耐药细胞大多是通过组织原代二维贴壁培养获得的。这种方法虽然简单易行，但是其获取的细胞多为无恶性胸腹水细胞。这意味着得到的细胞并不能代表所有的恶性胸腹水细胞。这些细胞通常处于腹水环境中，它们所处的液体环境是高蛋白和高炎症的，
2、因此，需要寻找一种更好的方法来解决这个问题。目前，正在尝试将二维贴壁培养转化为三维化培养，以期望能够得到更接近真实的恶性胸腹水细胞。然而，这个过程并不容易，可能会带来更多的困难，比如细胞活性的降低、药物敏感性的变化等。需要对这些问题进行全面的研究和分析，以找到最佳的解决方案。
3、基于上述问题限制了胸腹水药敏检测的实际临床应用。因此，临床不仅需要可以高度模拟体内微环境和生长方式的培养方法，并且需要成本及过程可控，操作方便的培养及药敏检测方法，并以三维培养阳性对照物作为质控，在通过前期临床一致性试验得出的药物浓度cutoff值作用下进行药物对组织的活性以及代谢的抑制反应测试，评价药物的敏感和耐药。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于为临床提供胸腹水三维培养药敏检测的方法。
2、本专利技术的技术方案：一种患者来源的恶性胸腹水细胞体外液基三维培养，基于含有相应患者自身胸腹水微环境的培养体系，恶性胸腹水细胞和部分淋巴细胞收集后使其在类体内样液基培养体系中进行空间增殖并自发形成具有一定三维结构的培养物，最后在与药物共培养条件下检测药物对三维培养物消耗葡萄糖代谢的影响和对细胞活性的影响。
3、进一步的，恶性胸腹水经过特定的方法分离获得：通过红细胞裂解，淋巴细胞分离液离心富集，磁珠去除过多淋巴细胞，最终富集获得原料细胞；也可以通过8-10μm滤膜过滤获得原料细胞。
4、进一步的，使用低吸附培养表面，将获取所述的原料细胞在患者自身来源的恶性胸腹水培养基中进行培养2-5天，模拟原始恶性胸腹水的营养微环境和悬浮生长状态，获得的种子三维培养物与原始细胞生物学特性一致性高，原料细胞中的淋巴细胞自组装到种子三维培养物中，反应原始恶性胸腹水所处的免疫微环境。
5、进一步的，所述获得的种子三维培养物在上述培养基中经过与待测药物及药物组合共培养。培养方法进一步包括：保存液配方包括，含有5％胎牛血清的hank's平衡液，含0.01％聚乙二醇，0.1％还原型谷胱甘肽，100u/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸链霉素，0.25μg/ml两性霉素b，0.01μg/ml阿奇霉素，0.1μg/ml氢化可的松，1μg/ml抗坏血酸，0.2mm 2-巯基乙醇，适用于运输环境，遵循保存方法，在72h的保存时间限度以内，有效延缓细胞离体后活性降低。
6、所述方法的培养基还考虑到了以下几个方面：
7、①通过保护并维护细胞的三维结构防止其崩解，其中包括对细胞外基质(ecm)的三维支架进行保护，这可以有效防止主要成分如透明质酸、胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白被破坏。同时，它也添加了基质金属酶抑制剂如多西环素1μg/ml，蛋白酶抑制剂如bestatin2μg/ml，以保护细胞间的连接和细胞与ecm之间的连接。此外，它还添加了氯化钙350μg/ml和左旋糖酐铁10μg/ml，以及抗氧化剂如β-巯基乙醇10μg/ml和维生素e 5μg/ml，这些都是为了提高培养基的稳定性。
8、②其次，该培养基能有效保护和维持微环境的组成，包括多种类型的肿瘤细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、免疫细胞等。这样能保证化疗药物、靶向药物、免疫药物(免疫细胞与肿瘤细胞互作)等大部分肿瘤临床治疗药物及其联合方案的有效使用。
9、③最后，这个培养基能有效减少液体的剪应力刺激，减低细胞在培养板上吸附的可能性，从而增加了细胞从培养板上脱离的难度。同时，培养基中还加入了高分子量的聚(乙二醇)二丙烯酸酯5μg/ml，去乙酰化结冷胶5μg/ml，海藻酸钠5μg/ml，这些物质都能提高培养基的抗组织崩解能力。
10、进一步的，本申请还提供了一种三维培养物对药物作用的反应通过检测细胞活性以及葡萄糖代谢进行检测并且评价抑制率。
11、进一步的，本申请还提供了一种提供能够抵抗药物和具备敏感性的标准样本。建立胸水细胞株的模型方法，将肺癌细胞进行逆转录病毒转染，并在裸小鼠的胸腔中接种。在60天之后，会收集pbs胸腔灌洗液，然后使用流式细胞仪对其中带有rfp标记的脱落细胞进行二次接种。这些耐药建模组的细胞会在接种7天后接受顺铂治疗，剂量为5mg/kg/周，而对照组则会接受等量的pbs。在90天之后，会再次收集pbs胸腔灌洗液，并使用流式细胞仪分离出顺铂耐药和敏感的胸水细胞株r和s。这些细胞株将被以1×105cell/管的形式储存在液氮中以备将来使用。
12、在复苏方法方面，取出一个冻存的细胞管，然后在37℃的水浴中迅速溶解，接着在700rpm下以2分钟的速度进行离心，最后丢弃冻存液，并将5ml 10％fbs的rp本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种恶性胸腹水细胞体外液基三维培养方法，特征在于：细胞收集后在类体内样液基培养体系中进行空间增殖并自发形成具有一定三维结构的培养物。
2.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：不添加细胞因子和/或基质胶。
3.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：包括利用低吸附培养板模拟体内悬浮生长状态，免除对基质胶的依赖。
4.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：还包括胸腹水离心后细胞悬液加入红细胞裂解液裂解，离心收集细胞，重悬，淋巴细胞分离液分离细胞，收取中间恶性细胞和淋巴细胞，加入磁珠吸附淋巴细胞并去除，离心收集剩余细胞。
5.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：通过8-10μm滤膜过滤，收集膜上细胞。
6.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：所述培养方法含有低吸附培养组合物。
7.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：所述三维培养方法含有胸腹水耐药和敏感的标准品构建方法。
8.一种患者来源恶性胸腹水细胞药物敏感性检测方法，特征在于：所述的药物敏感性检测为cutoff值单浓度的药物反应
9.根据权利要求8的药物敏感性检测方法，特征在于：所述的药物敏感性检测包括葡萄糖的代谢和MTT方法的终点检测。
10.根据权利要求8的药物敏感性检测方法，特征在于：所述的药物敏感性检测包括用于药物研发和筛选，药物药效学研究，临床患者化疗、靶向药物、免疫药物单用或者联合的敏感性预测及个性化治疗研究的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种恶性胸腹水细胞体外液基三维培养方法，特征在于：细胞收集后在类体内样液基培养体系中进行空间增殖并自发形成具有一定三维结构的培养物。
2.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：不添加细胞因子和/或基质胶。
3.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：包括利用低吸附培养板模拟体内悬浮生长状态，免除对基质胶的依赖。
4.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：还包括胸腹水离心后细胞悬液加入红细胞裂解液裂解，离心收集细胞，重悬，淋巴细胞分离液分离细胞，收取中间恶性细胞和淋巴细胞，加入磁珠吸附淋巴细胞并去除，离心收集剩余细胞。
5.根据权利要求1的三维培养方法，特征在于：通过8-10μm滤膜过滤，收集膜上细胞。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆重益，刘星，齐慧，唐美娟，阚震，翟鹏，
申请(专利权)人：安泰康生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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