检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片和试剂盒。上述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从肠致病性大肠杆菌（ＥＰＥＣ）的ｅａｅ基因、产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的ｌｔ、ＳＴａｐ和ＳＴａｈ基因、肠出血大肠杆菌（ＥＨＥＣ）的ｓｔｘ１和ｓｔｘ２、肠侵袭型大肠杆菌（ＥＩＥＣ）的ｉｐａＨ基因和大肠杆菌Ｏ１５７ｗｚｙ基因以及大肠杆菌１６ｓ基因中选取的ＤＮＡ片段或其互补的ＤＮＡ或ＲＮＡ序列。本发明专利技术还提供的试剂盒包括上述基因芯片。利用本发明专利技术的基因芯片和试剂盒检测致泻性大肠杆菌，操作简便，准确性高，重复性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片和试剂盒。
技术介绍
据世界卫生组织统计，除中国外，全世界每年有10亿人患腹泻，其中5亿人发生在 第三世界，导致每年5百万小儿死亡；中国每年有8. 36亿人次患腹泻，其中5岁以下小儿有 3亿人次。目前已知引起腹泻的病原体有数十种之多，中国国内报告以细菌性和病毒性腹泻 占多数。虽然不同自然环境、不同生产生活方式的地区引起腹泻病的主要病原体有所不同， 但统计表明致泻性大肠杆菌居第二位，为主要的致泻病原体。 肠致泻性大肠杆菌目前已发现5类，即 (1)肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli， ETEC):引起婴幼儿和旅游者 腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般2 3天即愈。营 养不良者可达数周，也可反复发作。致病因素是LT或ST，或两者同时致病。有些菌株具有 定居因子，常见者为06 :K15 :H16、025 :K7 :H42。鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清 型有一定参考意义。 (2)肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E. coli， EPEC):是婴儿腹泻的主要病 原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和 回肠上段大量繁殖。切片标本中可见细菌粘附于绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎縮、上皮细 胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻。 (3)肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E. coli， EIEC) :EIEC的多数菌株无动 力，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌，应予注意。 (4)肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli， EHEC):引起散发性或暴发 性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。EHEC的主要菌型是0157 :H7，还可有026、 0111等。 此外，肠粘附性大肠杆菌(Enteroadhesive E. coli， EAEC)也可引起腹泻，但对其 发病机理与血清型尚不了解。EAEC不侵入肠上皮细胞，不产生LT或ST，也无VT毒素。唯 一特征是具有与H印-2细胞(人喉上皮细胞癌细胞系)粘附的能力，故也称H印-2细胞粘 附性大肠杆菌。 致泻性大肠杆菌主要通过食品进行传播，所以对食品中致泻性大肠杆菌的检测非 常重要。传统致泻性大肠杆菌主要通过生化试验和血清学检测实现，但费时费力，且随着人 们的研究深入，发现致泻性大肠杆菌与血清型没有很好的相关性。因此，建立一种新的快 速、有效和可靠的致泻性大肠杆菌检测方法非常必要。 近年来用毒力基因检测致泻性大肠杆菌的报道很多，大家越来越认可致泻性大肠 杆菌的毒力基因具有很好的灵敏性和特异性，结合基因芯片方法的灵敏、特异、高通量的特点，同时检测多种致泻性大肠杆菌的多个毒力因子成为可能，大大降低成本，縮短检测时 间。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供食品和临床样品中的四种类型致泻性大肠杆菌检测的 基因芯片，四种类型分别为肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和 肠侵袭性大肠杆菌。以弥补传统检测食品和临床样品中的致泻性大肠杆菌检测技术存在的 费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，縮短检 测周期。 本专利技术所述的检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体 和固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从 以下基因序列中选取的一种或多种 1)从肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠 杆菌和大肠杆菌0157的基因中选取的DNA片段； 2)所述1)中的所述DNA片段的互补DNA片段。 本专利技术的较佳实施例中，上述从肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠出血 性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和大肠杆菌0157的基因中选取的DNA片段分别为从肠致 病性大肠杆菌的eae基因、产肠毒素大肠杆菌的lt、 stap和stah基因、肠出血大肠杆菌的 stxl和stx2基因、肠侵袭型大肠杆菌的ipaH基因和大肠杆菌0157wzy基因中选取的DNA 片段。 本专利技术的较佳实施例中，上述固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针具有SEQ ID NO :2-SEQ ID NO :24所示的核苷酸序列的至少一种。 本专利技术所述的基因芯片，还包括阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。 本专利技术的较佳实施例中，上述阳性对照探针为大肠杆菌16SrDNA序列片段，其具 有SEQ ID N0:25所示的核苷酸序列；阴性对照探针和荧光探针分别具有SEQ ID NO :26和 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。 本专利技术所述的基因芯片可用于检测产肠毒素大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠出 血大肠杆菌、肠侵袭型大肠杆菌、大肠杆菌0157中的至少一种。其中，在检测过程中，需使 用检测引物，该检测引物优选具有SEQ IDN0:27-SEQ ID NO :44所示的核苷酸序列中的至少一种。 本专利技术还提供一种检测检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的试剂盒，其包括 上述的基因芯片。 上述的试剂盒，还包括检测引物，该检测引物优选具有SEQ IDN0:27-SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列或其互补序列中的至少一种。 本专利技术所述的试剂盒还包含杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说 明书。 本专利技术所述的试剂盒可用于检测产肠毒素大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠出血 大肠杆菌、肠侵袭型大肠杆菌、大肠杆菌0157中的至少一种。 由上述的技术方案可见，本专利技术首次将基因芯片技术引入致泻性大肠杆菌检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的食品种致泻性大肠杆菌检测基因 芯片及其检测方法，利用本专利技术的基因芯片和试剂盒可以达到检测食品种致泻性大肠杆菌 的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，无论对于如出入境检验检疫部门对食品中致 泻性大肠杆菌检验检疫还是对食品加工企业及大型超市对致泻性大肠杆菌安全检验都有 重要的应用价值。 为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例， 并配合说明书附图，作详细说明如下。附图说明 图1为本专利技术基因芯片的一个实施例的外形示意图； 图2为本专利技术基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图； 图3A为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌eae基因时的杂交结果； 图3B为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌stah基因时的杂交结果; 图3C为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌stap基因时的杂交结果; 图3D为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌lt基因时的杂交结果; 图3E为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌stxl基因时的杂交结果; 图3F为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌stx2基因时的杂交结果; 图3G为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌ipaH基因时的杂交结果; 图3H为利用本专利技术的基因芯片检测食品中致泻性大肠杆菌wzy基因时的杂交结果。具体实施例方式实施例1探针的设计和制备 1.序列获得 (1) stxl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下基因序列中选取的一种或多种：　　１）从肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和大肠杆菌Ｏ１５７的基因中选取的ＤＮＡ片段；　　２）所述１）中的所述ＤＮＡ片段的互补ＤＮＡ或ＲＮＡ片段。

【技术特征摘要】
一种检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下基因序列中选取的一种或多种1)从肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和大肠杆菌O157的基因中选取的DNA片段；2)所述1)中的所述DNA片段的互补DNA或RNA片段。2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述从肠致病性大肠杆菌、产肠毒素 性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和大肠杆菌0157的基因中选取的DNA 片段分别为从肠致病性大肠杆菌的eae基因、产肠毒素大肠杆菌的lt、 stap和stah基因、 肠出血大肠杆菌的stxl和stx2基因、肠侵袭型大肠杆菌的ipaH基因和大肠杆菌0157wzy 基因中选取的DNA片段。3. 根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于所述固定在固相载体上的寡聚核 苷酸探针具有SEQ ID N0:2-SEQ ID NO :24所示的核苷酸序列的至少一种。4. 根据权利要求3所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，曾静，孙亚民，曹勃阳，王敏，喻群芳，
申请(专利权)人：天津生物芯片技术有限责任公司，中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]