用于膜离子交换色谱的介质制造技术

本发明专利技术涉及用于色谱用途的介质，其中，所述介质是具有涂覆有诸如聚乙烯亚胺等聚合物的表面的膜。所述固定聚合物涂层用电荷改性剂进行改性从而使介质具有季铵离子官能性。所述介质非常适合于病毒的色谱纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于膜离子交换色谱的介质，特别是用于病毒纯化的生物分离领域。
技术介绍
病毒纯化是新兴的生物分离领域。由于基因疗法临床研究必需大量的纯病毒，传统的纯化方法，即超离心不再经济。需要发展更快速、廉价和可扩展的纯化技术。色语已被用于病毒纯化，主要以小珠的形式。基于色谱的病毒纯化的首次报道可追溯到约半个世纪以前(参见例^口, Haruna， I.; Yaoi， H.; Kono, R. ; Watanabe， I.， Separation ofadenovirus by chromatography on DEAE-cellulose. Virology 1961, 13，(2)， 264 )。最近当小珠色镨的容量和使用限制日益严重时，膜色谗开始引起注意。诸如基于季铵离子等的那些强阴离子交换剂在下游处理中用作俘获在诸如生物流体，尤其是在制造的生物制剂溶液中存在的诸如内毒素、病毒、核酸和宿主细胞蛋白(HCP)等带负电荷的大块杂质的精制介质。传统上，在小珠形式中已经提供和使用了阴离子交换剂，例如来自GE Healthcare Bio-Sciences AB的Q Sepharose 。然而，基于小球的系统的通量限制要求大体积的柱子以有效地俘获杂质。在基于小球的色语中，可供吸附的大部分表面面积位于小珠内部。因此，由于质量输送通常受制于孔扩散，分离过程固有地緩慢。为了减小该扩散阻力并同时增大动态结合能力，可以采用小直径的小珠。然而，使用小直径珠子换来的代价是提高的柱压降。因此，制备色谱分离的优化通常牵涉到效率/动态容量(小珠有利的)和柱压降(大珠有利的)之间的折衷。相比而言，基于膜的色镨系统(也称之为膜吸着体)具有直接与4对流膜孔相连接的配体，因此消除了内部孔扩散对质量输送的影响。此外，具有紧密的膜孔度分布外加有效的流量分配器的微孔膜基材的使用能减小轴向分散并提供所有位点的均匀使用。因此，膜吸收介质的质量输送比标准基于小球的色语介质高一个数量级，使之同时具有高效率和高通量分离。由于与基于小球的介质填充的珠子相比，单层膜或平整堆叠的膜的非常薄，沿色谱床发现减小的压力降，因此提高流速和生产力。通过使用具有足够表面积的膜，制造具有非常大的直径高度比(d/h)的装置结构能实现必要的结合能力。由于大部分色语小珠的容量在小珠内部，基于膜的色语系统相比小珠所取得的优势在于被吸附实体的尺寸增大(例如从蛋白分子至病毒颗粒) 恰当设计的膜吸着体具有的色谱效率优于标准制备基于小球的树脂10~100倍。因此，为了在膜吸着体上实现相同水平的分离，可采用10倍小的床高度。相比基于小球的系统10 ~ 30 cm的床高度，1 ~5 mm的床长度对于膜吸着体是标准的。由于大体积膜吸着体所要求的极端柱边长比，装置设计是至关重要的。为了保持膜吸着体的固有性能优势，需要适当的入口和出口分配器以有效率地利用可用膜体积。膜吸着体技术理想地适用于该用途。然后，目前商业化膜吸着体具有各种缺点，包括低容量，较差的杂质分离以及难以洗脱经纯化的材料。吸收(absorption)指通过渗透将物质吸入吸收性材料体内。吸附(adsorption)指分子由体相运动至吸附介质表面。吸着(sorption)是包括吸附和吸收的总称。相类似地，本文中称之为吸着体的吸着材料或者吸着装置指或能吸附或能吸收或者能同时吸附或吸收的材料或装置。膜吸着体是高度多孔的相互连接的介质，具有当溶液流经其孔时移除(吸附和/或吸收)溶液中一些成分的能力。膜吸着体的性质及其在所需用途中良好地发挥作用的能力取决于介质的孔结构(骨架)以及暴露于所述溶液的表面的性质。通常，首先由在水中不溶解或者不溶胀并且具有可接受的机械性质的聚合物形成多孔介质。所述多孔介质优选为经过本领域广泛已知的相分离方法制造的多孔膜片。参见例如Zeman LJ， Zydney AL， Micro filtration and Ultrafiltration: Principlesand Applications, New York: Marcel Dekker， 1996。中空纤维和管状膜也是可接受的骨架。通常需要分离处理步骤以改性所形成的多孔结构的外部表面或外表面和内部孔表面从而引入必要的吸附性质。由于膜结构通常由疏水聚合物形成，表面改性步骤的另一目的也是使得所述表面亲水或者可水润湿的。本专利技术涉及经设计用于纯化诸如腺病毒等病毒的离子交换色镨介质。腺病毒是基因疗法研究中选摔的一种栽体。其稳定，非包膜并且能容易地感染细胞。最常见的类型是标记的Ad5。其容易地在实验室表达，但需要从细胞蛋白中彻底的纯化以避免在随后转染研究中假阳性信号的。当然，为其最终用途，即基因疗法和接种疫苗也需要纯腺病毒。电泳研究显示在大约8的pH时牢固地带有负电荷，而细胞溶解产物悬浮+液中大部分物种在该pH下具有较弱的电荷。这使得阴离子交换色谱是用于Ad5純化的合适技术。用于病毒移除和純化的阴离子交换膜先前已按照美国专利7，160，464的教导通过化学接枝技术进行制备。它教导了接枝有带有一个或多个带有正电荷的基团的聚合性侧链的膜的制备。熟悉膜修饰领域的技术人员将容易地理解接枝过程对于每种膜基材是特有的，需要先进的设备和繁复的开发工作。本专利技术提供了明显更简捷的方法基于膜的直接涂覆制造带有正电荷的膜吸着体。其他现有技术教导了没有直接将带有电荷的表面涂层连接到支持膜上的阴离子交换膜的制备。美国专利6,780,327教导了包括多孔性基材和具有聚合物骨架和悬吊正电荷基团的交联涂层的正电荷膜的制备，其中，每个悬吊正电荷基团通过单键经极性间隔基团直接与骨架相连。然而，极性间隔基团的存在带来了更多的膜表面和吸附剂分子之间的相互作用模式，诸如偶极相互作用和氢键。在传统生物分离条件下，后者极其难以调节。所希望的是形成主要通过电荷相互作用与溶液成分发生作用的吸着介质，而电荷相互作用可通过离子强度很容易地进行调节和精细调整。例如，在典型的腺病毒纯化应用中，高离子强度(高盐浓度)用于将病毒从膜上洗脱。如果存在其他相互作用，经纯化的病毒的产率可降低。因此，本专利技术公开了在多孔膜表面上形成交联涂层，其具有通过单 一 非极性联接基(linker)与涂层聚合物的骨架相连的正电荷基团。
技术实现思路
本专利技术已克服现有技术的问题，其提供了介质和装置，诸如包括该介质的阴离子交换剂，其中阴离子交换涂层形成在具有非特异性蛋6白结合的亲水性基材上。正电荷通过非极性联接基(linker)与涂层骨架 相连，基膜材料优选为超高分子量的聚乙烯。所述介质以结合-洗脱模 式发挥作用，洗脱受到高离子强度的促进。介质提供了优异的应用性 能、可碱性清洁性和容易的装置制造。在某些实施方式中，本专利技术涉及多孔性吸着(sorptive)介质，包括 具有第一外侧和第二外侧的基材(substrate)，两侧均为多孔性的，且之 间具有多孔性的厚度，所述基材为亲水性的，并且具有吸着材料，所 述吸着材料基本覆盖所述基材的固体基质(solid matrix)和所述第一和 第二外表面，所述吸着材料包括通过非极性联接基连接的季铵离子官 能性的交联聚合物。在某些实施方式中，交联聚合物用电荷改性剂进 行改性，所述电荷改性剂包括含有通过非极性联接基与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多孔性吸着介质，其包括具有第一外侧和第二外侧的基材，两侧均为多孔性的，且之间具有多孔性的厚度，所述基材为亲水性的，并且具有基本覆盖所述基材固体基质和所述第一和第二外表面的吸着材料，所述吸着材料包括具有通过非极性联接基连接的季铵离子官能性的交联聚合物。

【技术特征摘要】
US 2007-11-19 61/0036941. 一种多孔性吸着介质，其包括具有第一外侧和第二外侧的基材，两侧均为多孔性的，且之间具有多孔性的厚度，所述基材为亲水性的，并且具有基本覆盖所述基材固体基质和所述第一和第二外表面的吸着材料，所述吸着材料包括具有通过非极性联接基连接的季铵离子官能性的交联聚合物。2. 如权利要求1所述的多孔性吸着介质，其中，所述基材包括微孔膜。3. 如权利要求2的多孔性吸着介质，其中，所述膜包括聚烯烃。4. 如权利要求3所述的多孔性吸着介质，其中，所述聚烯烃是聚乙烯。5. 如权利要求1所述的多孔性吸着介质，其中，所述基材是超高分子量聚乙烯膜。6. 如权利要求1所述的多孔性涂敷介质，其中，所述交联聚合物包括聚乙烯亚胺。7. 如权利要求1所述的多孔性涂敷介质，其中，所述交联聚合物用电荷改性剂进行改性，所述电荷改性剂包括具有通过所述非极性联接基与能和所述交联聚合物进行反应的部分相连的季铵离子基团的有机化合物。8. 如权利要求7所迷的多孔性涂敷介质，其中，所述有机化合物可具有式Y-Z-N(CH3)3+X-，其中，Y是反应性离去基团，Z是非极性脂肪族或芳香族联接基，X是水溶性酸带有负电荷的离子。9. 如权利要求8所述的多孔性涂敷介质，其中，Y是选自由Br'、Cr、 r、 TsCr和C...

【专利技术属性】
技术研发人员：M科兹洛夫，
申请(专利权)人：米利波尔有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]