【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因修饰，尤其涉及一种用于构建ii型胶原蛋白人源化模型猪的方法及其应用。
技术介绍
1、骨关节炎(osteoarthritis，oa)是全球范围内最常见的慢性关节疾病，据估计，全球有超过2.4亿人口患有症状性骨关节炎。骨关节炎主要发生在中老年人群，常导致关节疼痛、僵硬，甚至导致残疾，严重影响患者的生活质量。随着全球人口老龄化和肥胖人群的增加，这一问题将进一步加剧，给社会医疗保健带来更大的负担。骨关节炎的发病与多种危险因素密切相关，包括年龄增长、肥胖、雌激素缺乏、创伤和遗传易感性等，其病理变化主要包括软骨破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜炎症等。骨关节炎是导致软骨损伤的主要原因之一。严重软骨损伤的患者需要进行关节软骨移植以改善生活质量。
2、在临床应用中，关节软骨移植材料主要来源于自体软骨、同种异体软骨以及组织工程人工软骨。自体软骨移植适用于治疗小范围的早期软骨损伤，但在大面积修复方面存在限制。同种异体移植相对容易获取，但仍面临来源有限和免疫排斥等问题。此外，与天然软骨相比，人工软骨在生物相容性、结构稳定性和长期功能维持等方面相对较差，导致排斥、感染和移位等不良反应的发生率较高。
3、猪、马、牛及狗等哺乳动物的异种软骨移植材料来源广泛、制备成本低，为天然软骨供体短缺提供了一个新的方向。其中，猪器官大小、解剖结构和生理特征与人更为相似，目前猪软骨细胞已被用于修复人类软骨缺损，同时细胞外基质(extracellular matrix，ecm)也被作为生物支架，应用于人工软骨组织工程。除此之外，猪易
4、近来，动物器官或组织人源化为异种间移植免疫排斥问题提供了一种解决方案，即通过基因编辑技术将猪软骨细胞中的特定基因替换为人软骨细胞中相应的基因，以降低移植后免疫排斥反应发生的风险。ii型胶原蛋白是关节软骨和椎间盘的主要组成成分，是关节软骨组织细胞外基质的重要组成部分，约占软骨组织干重的60％。在关节软骨中，ii型胶原蛋白形成纤维网状结构，与其他类型的胶原蛋白(如i型胶原蛋白)和蛋白多糖(如聚蛋白聚糖)相互作用，赋予软骨组织弹性和韧性，使其能够承受机械应力并保护关节。目前，ii型胶原蛋白作为生物支架材料被广泛用于关节软骨的修复重建和组织再生。它是实现猪软骨人源化的关键蛋白之一，其编码基因为col2a1。
5、因此，为了解决异种间移植免疫排斥问题，降低异种移植物的免疫原性等问题，十分有必要研究出关键蛋白等成分能够人源化的猪，提供人源化的猪器官等异种移植物。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于构建ii型胶原蛋白人源化模型猪的方法及其应用。
2、本专利技术主要解决的技术问题是提供了可用于实现人类ii型胶原蛋白编码序列被高效、精确整合到猪基因组内源性col2a1基因位点的同源打靶载体和单链向导rna(single-guide rna，sgrna)设计。同时，本专利技术还提供了利用所述打靶载体和sgrna修饰猪细胞并进一步构建ii型胶原蛋白人源化模型猪的方法与应用。本专利技术使用crispr/cas9基因编辑技术介导的同源重组方法，利用设计并构建的靶位点特异性sgrna和同源打靶载体对猪基因组进行精确修饰，将人源ii型胶原蛋白编码序列，定点整合到猪内源性基因col2a1启动子下游，利用猪内源性启动子驱动人源ii型胶原蛋白表达，同时阻断相应的猪内源性ii型胶原蛋白表达，实现ii型胶原蛋白人源化模型猪的构建。
3、本专利技术通过位点特异的sgrna引导cas9靶向切割猪col2a1基因起始密码子附近的序列，造成dna双链断裂，再利用外源给定的同源打靶载体，将猪的col2a1基因原位替换为人的col2a1基因，并结合体细胞核移植技术获得ii型胶原蛋白人源化模型猪，该模型猪的软骨组织更接近人体，可减少了人免疫系统对移植物的攻击，降低了免疫排斥反应的发生风险，从而提高软骨移植的成功率和治疗效果。
4、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
5、第一方面，本专利技术提供了一种靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统，所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统包括靶向猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的sgrna载体和含有人col2a1蛋白编码序列的同源打靶载体；
6、所述靶向猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的sgrna载体包含靶向猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的sgrna序列以及编码cas9核酸酶的核酸序列；所述sgrna的靶位点的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7、所述含有人col2a1蛋白编码序列的同源打靶载体包含供体dna，所述供体dna为依次连接的上游同源臂(5’同源臂)、人col2a1蛋白编码序列、bgh polya转录终止信号(pa)序列、嘌呤霉素抗性基因表达框(pgk-puro-pa)和下游同源臂(3’同源臂)；
8、所述上游同源臂(5’同源臂)的核苷酸序列如seq id no.6所示；
9、所述人col2a1蛋白编码序列的核苷酸序列如seq id no.7所示；
10、所述bgh polya转录终止信号(pa)序列的核苷酸序列如seq id no.8所示；
11、所述嘌呤霉素抗性基因表达框(pgk-puro-pa)的核苷酸序列如seq id no.9所示；
12、所述下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.10所示。
13、作为本专利技术所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统的优选实施方式，所述供体dna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
14、第二方面，本专利技术提供了所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统在构建ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪中的应用。
15、第三方面，本专利技术提供了一种构建ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪的试剂盒，包含所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统。
16、第四方面，本专利技术提供了一种ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系的构建方法，将所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1(col2a1)基因的crispr-cas9系统导入猪胎儿成纤维细胞系中，获得的中靶阳性单克隆细胞，即为ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系。
17、第五方面，本专利技术提供了一种ii型胶原蛋白人源化转基因猪重组胚胎的构建方法，以所述ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系的构建方法构建的ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系作为供核细胞，通过体细胞核移植获得猪重组胚胎。
18、第六本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统包括靶向猪Ⅱ型胶原α1基因的sgRNA载体和含有人COL2A1蛋白编码序列的同源打靶载体；
2.如权利要求1所述的靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述人COL2A1蛋白编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
3.如权利要求1所述的靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1～3任一项所述的靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统在构建II型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪中的应用。
5.一种构建II型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述靶向编辑猪Ⅱ型胶原α1基因的CRISPR-Cas9系统。
6.一种II型胶原蛋白人源化转基因细胞系的构建方法，其特征在于，将权利
7.一种II型胶原蛋白人源化转基因猪重组胚胎的构建方法，其特征在于，以权利要求6所述构建方法构建的II型胶原蛋白人源化转基因细胞系作为供核细胞，通过体细胞核移植获得猪重组胚胎。
8.一种II型胶原蛋白人源化转基因模型猪的构建方法，其特征在于，将权利要求7所述构建方法构建的II型胶原蛋白人源化转基因猪重组胚胎通过非手术法移入母猪输卵管内，妊娠后，获得II型胶原蛋白人源化转基因猪。
9.权利要求8所述II型胶原蛋白人源化转基因模型猪的构建方法在制备软骨移植材料中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向编辑猪ⅱ型胶原α1基因的crispr-cas9系统，其特征在于，所述靶向编辑猪ⅱ型胶原α1基因的crispr-cas9系统包括靶向猪ⅱ型胶原α1基因的sgrna载体和含有人col2a1蛋白编码序列的同源打靶载体；
2.如权利要求1所述的靶向编辑猪ⅱ型胶原α1基因的crispr-cas9系统，其特征在于，所述人col2a1蛋白编码序列的核苷酸序列如seq id no.7所示；
3.如权利要求1所述的靶向编辑猪ⅱ型胶原α1基因的crispr-cas9系统，其特征在于，所述供体dna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
4.权利要求1～3任一项所述的靶向编辑猪ⅱ型胶原α1基因的crispr-cas9系统在构建ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪中的应用。
5.一种构建ii型胶原蛋白人源化转基因细胞系、猪重组胚胎或模型猪的试剂盒，其特征在于，包含权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖良学，全龙泉，
申请(专利权)人：广州中科飞豚生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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