【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物细胞提取和分离方法，更具体地，涉及一种日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法。
技术介绍
1、肝脏中单核细胞在机体受到外来抗原侵入时，针对抗原所产生的特殊免疫细胞。该免疫细胞不仅可以用来研究机体对于侵入抗原所产生的的免疫机理，还可以作为实验材料，用于针对抗原所产生的疾病进行药物研究。
2、日本血吸虫病是一种虫卵肉芽肿引起的主要是肝脏和肠壁病变的慢性免疫性疾病.血吸虫性肝纤维化是血吸虫病发展的最后阶段,可以导致门静脉高压,腹水和上消化道出血,甚至死亡。因此,控制血吸虫病性肝纤维化是提高血吸虫病预后的关键。而分离获得日本血吸虫感染后小鼠肝脏中单核细胞，对于日本血吸虫病相关的疾病机理研究和药物治疗研究至关重要。
3、肝脏细胞传统的分离方法将肝脏组织研磨，根据细胞密度采用离心，去除肝实质细胞。如公告号为cn108300688b的中国专利技术专利公开了一种原代肝细胞分离和培养方法，该专利技术提供一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：步骤s1，穿刺活检肝组织，得到肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；步骤s2，将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；步骤s3，将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。使用该方法分离得到的免疫细胞得率较低，而且只能分离特定密度的细胞亚群，不能有效分离肝脏内单核免疫细胞。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供目的是提供一种日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，该分离方法操作
2、为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，包括如下步骤：
4、s1.对小鼠肝脏灌注，去除肝脏内血液；
5、s2.碎化肝脏组织，去除所述肝脏中纤维结缔组织后，对其进行组合酶消化；消化完成后，对组合酶灭活，得到混合液；
6、所述消化所使用的组合酶为含有iv型胶原酶和dnasei的pbs溶液，所述pbs溶液中iv型胶原酶和dnasei的质量比为5:1；
7、s3.去除混合液中团细胞及组织块后，与红细胞裂解液混合，除去残留在混合液中的红细胞；
8、s4.去除红细胞后，重悬混合液中细胞，离心除去肝实质，得沉淀细胞；
9、s5.将沉淀细胞与流式抗体稀释液混合，进行流式抗体孵育，孵育结束后使用流式细胞分选仪分选抗体阳性细胞亚群，得到肝脏单核细胞。
10、本专利技术通过特定种类的组合酶对日本血吸虫感染小鼠肝脏组织进行酶解消化，并结合流式细胞分选仪分选抗体阳性细胞亚群，得到高分离纯度和细胞活性的肝脏单核细胞。
11、进一步地，所述消化所使用的组合酶为含有0.5mg/ml的iv型胶原酶和0.1mg/ml的dnasei的pbs溶液。
12、优选地，步骤s1对肝脏灌注前，还需麻醉并固定小鼠。
13、优选地，所述麻醉采用2-4％戊巴比妥钠以0.005-0.020ml/g给药剂量腹腔注射。
14、进一步地，步骤s1对肝脏灌注通过左心室灌注肝脏消化液，所述肝脏消化液中含有0.4-0.6mg/ml的iv型胶原酶；肝脏无血色后停止灌注。
15、优选地，所述肝脏消化液的灌注在36-38℃条件下进行。
16、进一步地，步骤s2所述组合酶消化在36-38℃下震荡25-40min。
17、进一步地，步骤s3所述去除混合液中团细胞及组织块，通过将混合液过70μm细胞筛过滤。
18、进一步地，步骤s4所述离心除去肝实质，所述离心为3-5℃，转速200-400rpm离心2-4min。
19、进一步地，步骤s5将沉淀细胞与流式抗体稀释液混合前，还需将沉淀细胞进行重悬和离心；所述重悬为用40％的percoll将沉淀细胞充分混匀悬起定容至3-5ml，并在试管底部缓慢加入3-5ml 80％的percoll，放入离心机中进行密度梯度离心，离心条件为20-30℃，离心20-30min，离心力为800-1000g，升速5，降速1；离心结束后，取细胞层细胞作为纯化的沉淀细胞。
20、进一步地，步骤s5所述流式抗体稀释液其组成为用300μl facs buffer(1×pbs+2％fcs+1mm edta+0.1％nan3)按相应的稀释比例配制流式抗体稀释液(cd45-fitc、dapi-pb)，重悬细胞，4℃避光孵育25-35min。
21、本专利技术提供了上述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法分离得到的小鼠肝脏单核细胞。
22、本专利技术提供了上述小鼠肝脏单核细胞作为受试细胞或实验材料在开发日本血吸虫病药物中的应用。
23、本专利技术的有益效果为：
24、(1)本专利技术提供的日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法通过特定种类的组合酶对日本血吸虫感染小鼠肝脏组织进行酶解消化，并结合流式细胞分选仪分选抗体阳性细胞亚群，得到高分离纯度和细胞活性的肝脏单核细胞；
25、(2)本日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法相对于肝脏单细胞解离试剂盒便宜、易获得，操作更加简便。通过流式分选后，获得的肝脏的单核细胞纯度高，避免的肝脏组织碎片对后续实验的干扰。
26、(3)本日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法分离得到的小鼠肝脏单核细胞可作为受试细胞或实验材料在开发日本血吸虫病药物中的应用，利于血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞产业化推广。
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1.一种日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，所述消化所使用的组合酶为含有0.5mg/mL的IV型胶原酶和0.1mg/mL的DNaseI的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1对肝脏灌注通过左心室灌注肝脏消化液，所述肝脏消化液中含有0.4-0.6mg/mL的IV型胶原酶；肝脏无血色后停止灌注。
4.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S2所述组合酶消化在36-38℃下震荡25-40min。
5.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S3所述去除混合液中团细胞及组织块，通过将混合液过70μM细胞筛过滤。
6.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S4所述离心除去肝实质，所述离心为3-5℃，转速200-400rpm离心2-4min
7.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S5将沉淀细胞与流式抗体稀释液混合前，还需将沉淀细胞进行重悬和离心；所述重悬为用40％的Percoll将沉淀细胞充分混匀悬起定容至3-5mL，并在试管底部缓慢加入3-5mL80％的Percoll，放入离心机中进行密度梯度离心，离心条件为20-30℃，离心20-30min，离心力为800-1000g，升速5，降速1；离心结束后，取细胞层细胞作为纯化的沉淀细胞。
8.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S5所述流式抗体稀释液其组成为用300μMμL FACS buffer(1×PBS+2％FCS+1mM EDTA+0.1％NaN3)按相应的稀释比例配制流式抗体稀释液(CD45-FITC、DAPI-PB)，重悬细胞，4℃避光孵育25-35min。
9.根据权利要求1-8任意一项所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法分离得到的小鼠肝脏单核细胞。
10.根据权利要求9所述小鼠肝脏单核细胞作为受试细胞或实验材料在开发日本血吸虫病药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，所述消化所使用的组合酶为含有0.5mg/ml的iv型胶原酶和0.1mg/ml的dnasei的pbs溶液。
3.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1对肝脏灌注通过左心室灌注肝脏消化液，所述肝脏消化液中含有0.4-0.6mg/ml的iv型胶原酶；肝脏无血色后停止灌注。
4.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s2所述组合酶消化在36-38℃下震荡25-40min。
5.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s3所述去除混合液中团细胞及组织块，通过将混合液过70μm细胞筛过滤。
6.根据权利要求1所述日本血吸虫感染小鼠肝脏中单核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s4所述离心除去肝实质，所述离心为3-5℃，转速200-400rpm离心2-4min。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张英，张蓓，戴洋，乔树苗，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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