【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及噬菌体抗体展示库，具体来说涉及一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用。
技术介绍
1、噬菌体抗体展示库是将抗体与噬菌体的外壳蛋白的n末端融合表达，从而使抗体表达于噬菌体表面，若不同的噬菌体携带不同的抗体，多个不同的噬菌体则构成不同抗体的集合。在实际操作过程中，其可以以噬菌粒、噬菌体或携带噬菌粒的大肠杆菌三种形式存在。自1985年美国生物化学家乔治·史密斯(georgep.smith)博士专利技术噬菌体展示技术以来，噬菌体抗体展示库被广泛运用于抗体发现，大大加快了抗体开发的进程，被证明是十分行之有效的技术手段，特别是其可用于筛选全人源抗体、或者无法形成杂交瘤的b细胞抗体。
2、目前，噬菌体抗体展示库从所展示的抗体的结构来看有scfv(single-chainvariablefragment)、f(ab)(fragmentofantigenbinding)、f(ab')2(二价的fab)和sdab(singledomainantibody)，其中sdab包括驼类来源的vhh(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)和鲨鱼来源的vnar(variabledomainofimmunoglobulinnewantigenreceptor)。scfv和f(ab)抗体库发展较早，sdab则是近年获得大量关注抗体类型。2002年全球第一个全人源单克隆抗体—阿达木单抗获批上市，用于自身免疫疾病的治疗，其是全球首个通过噬菌体展示技术获得并获批上市的药用抗体；2
3、car的检测在car细胞类药品的研发过程中必不可少，例如car阳性率检测、car细胞扩增检测、car细胞体内分布与代谢检测，甚至其检测结果决定后续研发方向。另一方面，car细胞药物研发过程中往往存在多个候选分子，特别是研发早期阶段，甚至多达几十个候选分子需要进行检测，难以针对一个抗体制备相应的检测试剂；若使用抗原进行检测，往往因为car细胞所使用的抗体结合能力低、表达强度较弱因而难以检测。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，利用其筛选获得的抗体均带有特定的标签肽，对car进行检测时，所有的car只需检测一种特定的、易于检测的标签肽，大大便利car的检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，包括以下步骤：
3、s01、rna提取与反转录：
4、s11、加入0.3ml氯仿，摇匀后室温静置分层；
5、s12、4℃下12000rpm离心10min；
6、s13、转移上层水相于新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积预冷异丙醇混匀，4℃沉淀30min；
7、s14、4℃下12000rpm离心10min；
8、s15、弃上清，加入1.5ml70％乙醇洗涤沉淀，将洗液吸除干净，室温干燥5min；
9、s16、加入20μl无rna酶去离子水，吹吸使rna沉淀充分溶解；
10、s17、将总rna加到1.5％argarose胶孔中，1×tae电泳缓冲液中快速电泳分离；
11、s18、按以下顺序加入反转录反应物：
12、模板rna 3μg
13、oligo(dt)18引物 1μl
14、无核酸酶的去离子水 补至12μl
15、70℃孵育5min，立即于冰上冷却；
16、
17、
18、42℃孵育40min，结束后-70℃保存；
19、s02、抗体基因第一轮扩增及胶回收：
20、s21、按以下顺序加入反应物
21、
22、s22、按以下程序运行pcr扩增：94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min内需要扩增循环25次；
23、s23、将扩增产物加到1％琼脂糖胶孔中，1×tae电泳缓冲液中电泳分离；
24、s24、切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段。
25、s03、抗体基因第二轮扩增及胶回收：
26、s31、按以下顺序加入反应物
27、
28、s32、按以下程序运行pcr扩增：94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min内需要扩增循环15次；
29、s33、扩增产物加到1％argarose胶孔中，1×tae电泳缓冲液中电泳分离；
30、s34、切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段；
31、s04、噬菌体展示抗体文库淘选：
32、s41、宿主菌tg1活化：制备miniagar培养基平板，划线法过夜培养tg1于37℃培养箱；
33、s42、磁珠洗涤及封闭：吸取50μl磁珠，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1mlpbs重悬、洗涤两次，用1ml1.5％脱脂奶粉+1.5％bsa的封闭剂封闭1小时，去除液体；
34、s43、抗原结合：按16μg/ml的浓度将人源cd70蛋白用pbs(ph7.2-7.4)稀释至1ml，重悬磁珠，旋转孵育1小时；
35、s44、库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒，用1ml1.0％脱脂奶粉+1.0％bsa的封闭剂旋转孵育1小时；
36、s45、噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体。将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体；
37、s46、洗涤：用1mlpbst[0.01mpbs洗涤，再用0.01mpbs(ph7.4)洗涤；
38、s47、洗脱：吸去液体，用300μl0.2m甘氨酸-盐酸(ph2.2)洗脱10min，加入20μl中和液[1mtris-cl(ph9.0)]混匀，暂时保存于4℃；
39、s48、测滴度：取2μl的第一洗脱液、由原液用2×yt培养基稀释10倍后取2μl的第二洗脱液、0由原液用2×yt培养基稀释100倍后取2μl的第三洗脱液，第一洗脱液、第二洗脱液和第三洗脱液与0.2ml对数中期(od600＝0.5)的tg1混匀，室温孵育30min，均匀涂于2×本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤21中的miniagar培养基平板包括1×M9盐，2％葡萄糖，2mMMgSO4，0.1mMCaCl2，1mM维生素B1。
3.根据权利要求1所述的一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤50中重复执行步骤41到步骤50的过程中，所述1.5％BSA的封闭剂的容易位于第二轮、第三轮淘选时逐渐增加。
4.根据权利要求1所述的一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤44中的1011pfu噬菌体病毒颗粒为原始抗体库或淘选扩增产物。
5.根据权利要求1所述的一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤46中所述1mLPBST包括0.01MPBS(pH7.4)和0.1％Tween-20，且0.1％Tween-20在第二、三轮Tween-20浓度分别用0.2％和0.3％。
6.根据权利要求
7.根据权利要求1所述的人源CD70空间表位抗体，其特征在于，所述步骤85中流式细胞仪上检测获取的噬菌体展示抗体库的保护抗体序号如下：
...【技术特征摘要】
1.一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤21中的miniagar培养基平板包括1×m9盐，2％葡萄糖，2mmmgso4，0.1mmcacl2，1mm维生素b1。
3.根据权利要求1所述的一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤50中重复执行步骤41到步骤50的过程中，所述1.5％bsa的封闭剂的容易位于第二轮、第三轮淘选时逐渐增加。
4.根据权利要求1所述的一种便于cart检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，所述步骤44中的1011pfu...
【专利技术属性】
技术研发人员：林渭金，王新平，
申请(专利权)人：南京康和细胞基因工程研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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