【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体是一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体、嵌合抗原受体car-t细胞及其应用。
技术介绍
1、随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigen receptor t-cell immunotherapy，car-t)已经成为当下肿瘤免疫治疗中的最热门最有研究价值的治疗方法。目前，car-t治疗在血液肿瘤中取得了很好的进展，但是由于实体肿瘤微环境复杂，car-t对实体瘤的杀伤效果有限，因此，需要探索新的方法来提高car-t治疗实体肿瘤的活性。
2、car的基础设计中包括肿瘤相关抗原结合区、胞内信号区、跨膜区、胞外铰链区等。纳米抗体，也称为vhh抗体或单域抗体，是一种特殊类型的抗体，由骆驼、骡子等动物产生，具有与常规抗体相似的结构和功能。纳米抗体是目前最小的功能性抗原特异性结合天然片段，由约为120个氨基酸组成，长度4nm，直径2.5nm。相对于传统的单克隆抗体以及fab片段(55×103)或者scfv(28×103)，纳米抗体的分子量更小，因此具有更强、更快的组织透过能力，能够到达实体瘤等致密组织发挥作用。除此之外，纳米抗体稳定性好，亲和力较高、免疫原性弱、易于进行基因改造，不会出现传统抗体容易产生错误配对以及需要优化重链和轻链连接序列问题等优点，在肿瘤免疫治疗等方面展现了广阔的应用前景。
3、cd70是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，tnfr)超家族的成员之一，具有调控t细胞和
4、b7-h3是一种免疫球蛋白超家族成员，在肿瘤免疫学中扮演重要角色。它通常在多种肿瘤类型中高表达，包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌。b7-h3的高表达与肿瘤的侵袭性和预后不良相关。
5、虽然目前靶向cd70或b7-h3的car-t细胞在对应的癌种中已经取得了一定的治疗效果，但仍然面临着一定的阻碍，比如靶抗原的丢失或肿瘤异质性高等，一旦肿瘤细胞的靶抗原丢失，car-t细胞就无法发挥出应有的肿瘤杀伤能力。因此，本专利技术构建的同时靶向两种抗原的双靶点car-t可以降低肿瘤的复发率，从而提高肿瘤的治疗效果。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体、嵌合抗原受体car-t细胞及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，所述双靶点嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包含cd70和b7h3的结合结构域。
4、作为本专利技术进一步的方案：所述双靶点嵌合抗原受体包含依次串联的cd8leader、靶向cd70的纳米抗体，靶向b7h3的纳米抗体、铰链区cd8a、跨膜区cd28、胞内共刺激域cd28和胞内信号转导域cd3ζ，形成cd8al-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白；其中，vhh1为靶向cd70的抗原结合结构域，vhh2为靶向b7h3的抗原抗体结构域。
5、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，cd8 leader的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，anti-cd70 vhh的氨基酸序列如seq id no：2所示。
7、作为本专利技术再进一步的方案：所述双靶点嵌合抗原受体还包括连接序列，所述连接序列连接在所述靶向cd70的纳米抗体和所述靶向b7h3的纳米抗体之间，所述连接片段为(g4s)n或(eaaak)n，n为1、2、3。
8、作为优选，所述连接片段为(g4s)n，n为3，所述连接序列的核苷酸序列如seq idno：3所示。
9、优选地，所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，anti-cd70vhh的氨基酸序列如seq id no：4所示。
10、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，cd8a hinge的氨基酸序列如seq id no:5所示。
11、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，cd28tm的氨基酸序列如seq id no:6所示。
12、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，cd28的氨基酸序列如seq id no:7所示，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:8所示。
13、作为本专利技术再进一步的方案：所述cd8a
14、l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:9所示。
15、所述b7h3和cd70抗体序列为本专利所述或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
16、编码上述的双靶点嵌合抗原受体的多核苷酸。
17、一种病毒载体，所述载体包括上述的同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体的对应编码基因。
18、一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体car-t细胞，包括上述的同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，car-t细胞表达上述的嵌合抗原受体。
19、本专利技术制备成的car-t细胞在对cd70阳性或b7h3阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤作用，而对cd70或b7h3弱表达的正常组织细胞没有杀伤作用，并且能够保持较高的增殖能力以及较低的耗竭指标。
20、一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体car-t细胞的应用，在制备抗肿瘤药物中的应用，包括实体瘤和血液瘤，所述肿瘤优选为肾癌，所述肿瘤为单一表达或同时表达cd70和b7h3的肿瘤，或经b7h3 car-t或cd70car-t治疗后因抗原丢失而无效的肿瘤。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别b7h3或cd70单阳的肿瘤细胞，还可以识别b7h3和cd70共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的car-t细胞具有更强的抗肿瘤免疫活性和更本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
2.根据权利要求1所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体包含依次串联的CD8 Leader、靶向CD70的纳米抗体，靶向B7H3的纳米抗体、铰链区CD8a、跨膜区CD28、胞内共刺激域CD28和胞内信号转导域CD3ζ，形成CD8a
3.根据权利要求2所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8a L-VHH1-I-VHH2-H-CD28TMCD28-CD3ζ融合蛋白中，CD8 Leader的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求2所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8a L-VHH1-I-VHH2-H-CD28TMCD28-CD3ζ融合蛋白中，anti-CD70 VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求2所述的一
6.根据权利要求2所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8a L-VHH1-I-VHH2-H-CD28TMCD28-CD3ζ融合蛋白中，CD28TM的氨基酸序列如SEQID NO:6所示。
7.根据权利要求2所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8a L-VHH1-I-VHH2-H-CD28TMCD28-CD3ζ融合蛋白中，CD28的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
8.根据权利要求2所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8a L-VHH1-I-VHH2-H-CD28TMCD28-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
9.一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体CAR-T细胞，其特征在于：包括权利要求1～8中任一项所述的同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体。
10.根据权利要求9所述的一种同时靶向CD70和B7H3的双靶点嵌合抗原受体CAR-T细胞的应用，其特征在于：在制备抗肿瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
2.根据权利要求1所述的一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体包含依次串联的cd8 leader、靶向cd70的纳米抗体，靶向b7h3的纳米抗体、铰链区cd8a、跨膜区cd28、胞内共刺激域cd28和胞内信号转导域cd3ζ，形成cd8a
3.根据权利要求2所述的一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，cd8 leader的氨基酸序列如seq id no：1所示。
4.根据权利要求2所述的一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，anti-cd70 vhh的氨基酸序列如seq id no：2所示。
5.根据权利要求2所述的一种同时靶向cd70和b7h3的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述cd8a l-vhh1-i-vhh2-h-cd28tmcd28-cd3ζ融合蛋白中，c...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄庭晖，张照，陈正亮，
申请(专利权)人：南京康和细胞基因工程研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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