一种黄素依赖型烯烃还原酶的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄素依赖型的烯烃还原酶（OPR1），通过可见光激发OPR1使其产生非天然活性催化生成自由基，从而用来催化RAFT聚合，该方法实现了对可控自由基聚合反应的动态调控，具有更强的生物相容性和绿色可持续性。通过半理性设计和定向进化策略，对OPR1进行改造，获得突变体蛋白，使其催化RAFT聚合活性提高。光酶OPR1突变体的催化活性达到野生型的1.4倍~2.2倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质工程及光酶的应用领域，更具体的说是提供了一种新的黄素依赖型烯烃还原酶及其突变体在可控自由基聚合领域中的应用。

技术介绍

1、将光催化和酶催化结合起来的光酶催化，展现出新的催化活性，为光催化领域和酶催化领域都注入了新的活力，成为催化领域研究的热点之一。特别是近年来一些研究通过光激发自然界中的非光酶产生了非天然光反应，比如hyster课题组报道了光激发黄素依赖的烯烃还原酶实现了分子内自由基环化反应，赵惠民课题组报道了光激发黄素依赖的烯烃还原酶实现了非天然的两分子交叉偶联反应等。这些研究中利用可见光激发口袋内的底物-辅因子络合物或者直接激发还原态的辅因子，开发出了基态无法进行的自由基化学，并且借助于酶完成了立体选择性的氢原子转移步骤。然而，这类光酶催化自由基生成的活性的应用还可以进一步拓展，并且目前针对这类具有新光酶活性的烯烃还原酶的蛋白质工程研究还较少，对于其关键活性位点的结构与功能之间的关系的研究也较少。

2、因此，受此启发，本专利技术将这类黄素依赖的烯烃还原酶应用在了可控自由基聚合领域，用黄素依赖的烯烃还原酶opr1催化可逆本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种烯烃还原酶OPR1及其突变体在可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合中的应用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含烯烃还原酶OPR1的载体的构建方法如下：选择来自Solanum lycopersicum的黄素依赖型烯烃还原酶基因（核苷酸序列如SEQ IDNO.9，氨基酸序列如SEQ ID NO.1）按照大肠杆菌作为底盘菌株进行全基因密码子优化及合成，采用酶切连接（酶切位点为NdeⅠ和XhoⅠ）的方法，将基因与质粒pET-22b连接构建重组表达载体pET-22b-OPR1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表达烯烃还原酶OPR1的工程菌株的...

【技术特征摘要】

1.一种烯烃还原酶opr1及其突变体在可逆加成-断裂链转移（raft）聚合中的应用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含烯烃还原酶opr1的载体的构建方法如下：选择来自solanum lycopersicum的黄素依赖型烯烃还原酶基因（核苷酸序列如seq idno.9，氨基酸序列如seq id no.1）按照大肠杆菌作为底盘菌株进行全基因密码子优化及合成，采用酶切连接（酶切位点为ndeⅰ和xhoⅰ）的方法，将基因与质粒pet-22b连接构建重组表达载体pet-22b-opr1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表达烯烃还原酶opr1的工程菌株的构建方法，将权利要求1中所述重组表达载体pet-22b-opr1转入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，获得重组菌株e.coli bl21(de3)/ pet-22b-opr1（即为亲本菌株）。

4.根据权利要求1所述的烯烃还原酶opr1突变体，其特征在于所述突变体是将seq idno.1所示氨基酸序列的第192位酪氨酸突变为苯丙氨酸（seq id no.2），第192位酪氨酸突变为丝氨酸（seq id no.3），第246位酪氨酸突变为精氨酸（seq id no.4），第332位亮氨酸突变为天冬氨酸（seq id no.5），第332位亮氨酸突变为组氨酸（seq id no.6），第358位酪氨酸突变为甲硫氨酸（seq id no.7），第358位酪氨酸突变为精氨酸（seq id no.8）获得。

5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琳，宋浩，李超，宗奕吾，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：