基于CRISPR-Cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统及应用，所述的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统包括以pLCNICK为骨架构建得到的基因编辑质粒，所述的基因编辑质粒中含有识别特异性靶序列的sgRNAs以及所要插入或敲除位点的上下游同源序列，其连接顺序为上游同源序列‑下游同源序列‑sgRNAs。所述的系统用于外源基因插入时，还包括在上、下游同源序列中间插入外源基因序列。本发明专利技术利用CRISPR‑Cas9系统和营养缺陷型选择标记建立了一套在乳酸菌基因组任意位点进行插入、缺失或突变操作的基因组编辑系统，实现了对不同乳酸菌菌株的不同基因位点高效、精确敲除及插入，实现了乳酸菌系统复制的人工控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统及应用，特别涉及一种基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统及应用。本专利技术属于微生物改造。

技术介绍

1、乳酸菌作为食品级微生物，安全性高、不产生内毒素，具有非致病性特点；还具有抗胃酸、耐消化液、定植肠道黏膜、免疫佐剂效应、增强黏膜疫苗的免疫调节和非特异性抗腹泻等特点常被用作口服疫苗传递载体，从而建立阻断病原感染第一道防线以达到预防疾病的目的。

2、利用乳酸菌作为口服疫苗传递载体来表达外源基因的技术，目前主要有质粒表达系统和基因组操作系统。目前报道的乳酸菌质粒表达载体系统，一般所使用的选择性标记大多数都是抗生素抗性标记，这增加了抗生素耐药性对人类肠道微生物菌群转移的风险；质粒中存在抗性基因使乳酸菌作为人和动物疫苗存在着重大生物安全隐患，对生物安全性产生了严重危害；同时质粒表达系统还存在表达不稳定性，并且质粒在细菌增殖过程中可发生丢失现象。利用同源重组及基因打靶技术对乳酸菌基因进行操作来实现外源基因的插入与敲除技术也存在缺点，如筛选依赖抗生素等选择标记；许多转座转化效率和重组插本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于CRISPR-Cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统包括以pLCNICK为骨架构建得到的基因编辑质粒，所述的基因编辑质粒中含有识别特异性靶序列的sgRNAs以及所要插入或敲除位点的上下游同源序列，其连接顺序为上游同源序列-下游同源序列-sgRNAs。

2.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的系统还包括干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L.caseiW56，所述的副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌L.paracaseiHLJ-27。<...

【技术特征摘要】

1.一种基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统包括以plcnick为骨架构建得到的基因编辑质粒，所述的基因编辑质粒中含有识别特异性靶序列的sgrnas以及所要插入或敲除位点的上下游同源序列，其连接顺序为上游同源序列-下游同源序列-sgrnas。

2.如权利要求1所述的基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的系统还包括干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌l.caseiw56，所述的副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌l.paracaseihlj-27。

3.如权利要求1所述的基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的营养缺陷型乳酸菌为丙氨酸消旋酶营养缺陷型干酪乳杆菌或丙氨酸消旋酶营养缺陷型副干酪乳杆菌。

4.如权利要求1所述的基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，所述的系统用于外源基因插入时，还包括在上、下游同源序列中间插入外源基因序列。

5.如权利要求1所述的基于crispr-cas9系统的营养缺陷型乳酸菌基因编辑系统，其特征在于，当所述的营养缺陷型乳酸菌为丙氨酸消旋酶营养缺陷型干酪乳杆菌时，所述的上、下游同源序列分别如seq id no.1和2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓娜，李佳璇，张海琳，赵海渊，李一经，唐丽杰，姜艳平，崔文，李封赛，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：