基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法及应用，方法包括：构建标准内参体系：以如序列SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.9所示内参基因经扩增后的质粒标记为RCA_BSI1、RCA_BSI2、RCA_BSI3、RCA_BSI4、RCA_BSI5、RCA_BSI6、RCA_BSI7、RCA_BSI8、RCA_BSI9，并在缓冲液中形成具有梯度浓度的标准体系；构建测序文库：将样本提取全部DNA，确定其具有浓度一致性和完整度后，适量加入所述标准内参体系，打断DNA至适当长度范围，至少经末端修复补齐、加A、连接接头、片段长度分选，再PCR扩增获得测序文库，对所述测序文库进行测序获得PE150测序数据；构建RCA标准曲线：测序数据与所述质粒序列比对提取数据，绘制标准曲线，并获得线性方程；依据线性方程，计算样本目标对应的绝对拷贝数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于生物技术，特别是关于一种基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法及应用。

技术介绍

1、伴随着ngs测序的发展，鸟枪法宏基因组测序，逐步成为研究微生物群落结构的有力工具。不同于传统的16s，its扩增子测序，鸟枪法宏基因组测序对宏样本中所有的dna序列进行测序、分析和研究，实现对物种更高的分辨率注释；除群落结构研究外，通过对序列从头组装、基因结构预测与基因功能注释，更能实现对宏样本中基因功能的研究。将宏基因组的研究从扩增子时代的“样本中有什么微生物”发展成为“样本中这些微生物在干什么”。进一步的，随着mgs，binning分析等生信技术的发展，使得从宏样本数据中组装出完整的微生物基因组成为可能，对于无法分离培养的微生物，其重要性不言而喻。然而，传统的鸟枪法宏基因组测序技术仅关注了研究对象中的物种与功能组成，是一种只关注比例的相对定量实验；随着研究的逐步深入，关注的科学问题日趋复杂，对宏样本进行绝对定量的研究已逐渐成为行业共识。在扩增子测序中，基于内参测序法、qpcr法的绝对定量技术已逐渐普及，再综合大量的研究结果后，nature biotech本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，包括：

2.如权利要求1所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述标准内参体系中内参基因的添加量满足，以总体积1350μL计：RCA_BSI1和RCA_BSI2的量均为10000ng、RCA_BSI3和RCA_BSI4的量均为1000ng、RCA_BSI5和RCA_BSI6的量均为100ng、RCA_BSI7和RCA_BSI9的量均为10ng。

3.如权利要求1所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述扩增为将所述内参基因插入到载体质粒后转染感受态细胞，再挑选单克隆细胞进行培养，培养...

【技术特征摘要】

1.一种基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，包括：

2.如权利要求1所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述标准内参体系中内参基因的添加量满足，以总体积1350μl计：rca_bsi1和rca_bsi2的量均为10000ng、rca_bsi3和rca_bsi4的量均为1000ng、rca_bsi5和rca_bsi6的量均为100ng、rca_bsi7和rca_bsi9的量均为10ng。

3.如权利要求1所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述扩增为将所述内参基因插入到载体质粒后转染感受态细胞，再挑选单克隆细胞进行培养，培养后抽提质粒进行滚环扩增。

4.如权利要求3所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述感受态细胞选自：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。

5.如权利要求3所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述培养所采用的培养基选自：lb培养基、nb培养基，ypd培养基。

6.如权利要求1所述的基于梯度内参的宏基因组绝对定量的方法，其特征在于，所述样本选自土壤、粪便、污水。

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【专利技术属性】
技术研发人员：方欧，檀兴燕，
申请(专利权)人：上海天昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：