【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及高活性pu解聚酶突变体及其应用。
技术介绍
1、聚氨酯是世界第六大塑料，具有耐磨、抗撕裂、耐油和耐老化的性能等优异的物理和化学性能，主要应用在家居，建筑，交通等热固性的软泡和硬泡，以及制鞋，服装等热塑性聚氨酯等领域。
2、目前，处理聚氨酯(pu)废弃物的主要方法包括直接填埋、焚烧、机械回收和化学回收。填埋作为最原始的处理方式，不仅占用土地，还会污染水土资源，并且耗费大量人力物力；焚烧过程中会产生有毒有害物质，如氮氧化物、苯、甲醛等对人体健康构成潜在威胁；机械回收主要涉及将pu废弃物研磨、粉碎或切割成小块，然后再用于制造新的pu产品，但回收过程需要较高的温度和压力条件，存在较大限制。化学回收需要复杂的工艺和设备，导致回收成本较高。相比之下，利用生物法(微生物或酶)降解pu塑料，不仅避免了传统物理或化学方法产生的有害气体或副产品，而且更符合环境可持续性要求，减少了对环境的负面影响。
3、来源于pseudomonas chlororaphis的酯酶puea和pueb，于1.5％(v/v)的dln平板，23℃反应6h后，平板表面出现明显的水解圈；来源于candida antarctica的脂肪酶calb，37℃，反应24h后，对pcl型聚酯型pu泡沫的重量损失为25％；magnin等人研究了一种可以降解不同种类pu的漆酶介导的系统(lms)，可通过水解酯键和醚键对pu进行解聚。在37℃孵育18d，泡沫的质量损失分别为12.1％。迄今为止鉴定的pu解聚酶绝大多数仅能水解聚酯型pu
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供高活性pu解聚酶突变体及其应用。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术公开了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种对pu塑料具有高解聚活性的突变体蛋白，为如下1)-8)中任一种：
4、l)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第196位的色氨酸突变为丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
5、2)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第276位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
6、3)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第224位的组氨酸突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
7、4)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第141位的亮氨酸突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
8、5)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第29位的谷氨酸突变为丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
9、6)所示的蛋白为将seq id no:2所示pu解聚酶氨基酸序列中第89位的组氨酸突变为丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，得到的具有pu解聚酶活性的蛋白；
10、7)所示的蛋白为将1)-6)中任一种蛋白中除去突变位点外，其他氨基酸残基同源性大于99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性，且具有pu解聚酶活性的蛋白；
11、8)所示的蛋白为将1)-7)中任一种蛋白的氨基酸序列c端添加6xhis标签序列得到的具有pu解聚酶活性的蛋白质。
12、所述野生型pu解聚酶(aes72)的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
13、上述对pu塑料具有高解聚活性的突变体蛋白1)-6)为将所述野生型pu解聚酶氨基酸序列中第196、276、224、141、29、89位中的氨基酸残基进行突变后得到，所得突变体蛋白分别命名为w196a、f276a、h224yl、141i、e29a、h89a。所述突变体w196a、f276a、h224yl、141i、e29a、h89a与野生型aes72相比，活性有明显的提高。
14、第二方面，本专利技术公开了一种编码基因，其为编码上述第一方面所述蛋白的基因。
15、第二方面，本专利技术公开了含有上述第二方面所述编码基因的重组质粒。
16、第三方面，本专利技术公开了上述第一方面所述蛋白、第二方面所述编码基因、以及第三方面所述重组载体或重组菌的应用。
17、所述应用为如下a)和b)中至少一种；
18、a)降解聚醚型pu；
19、b)降解聚酯型pu。
20、其中，所述聚醚型pu和聚酯型pu包括底物聚醚型pu和聚酯型pu，也包括消费后的pu产品，如废弃枕头、废弃车垫等。
21、所述应用具体包括如下步骤：将第一方面所述蛋白的粗酶液或纯化蛋白添加至pu降解体系，实现pu降解。
22、其中，所述粗酶液或纯化蛋白的添加量为：以蛋白质量计，pu降解体系中蛋白浓度为底物浓度的10wt％-20wt％，如15wt％。
23、有益效果：
24、本专利技术利用结构分析及定点突变技术将野生pu解聚酶(aes72)进行突变，得到六种突变体，有效提高aes72降解pu的活性。pu是一个难以降解的不溶性高聚物，本专利技术六种突变体大大提高了pu塑料的降解效率，工业应用前景良好。
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1.一种蛋白，为如下1)-8)中任一种：
2.编码权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组质粒。
4.权利要求1所述蛋白在如下a)和b)中至少一种中的应用：
5.权利要求2所述核酸分子在如下a)和b)中至少一种中的应用：
6.权利要求3所述重组载体或重组菌在如下a)和b)中至少一种中的应用：
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述聚醚型PU和聚酯型PU包括废弃枕头、废弃车垫。
8.根据权利要求4-6中任意一项所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述蛋白的粗酶液或纯化蛋白添加至PU降解体系，实现PU降解。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述粗酶液或纯化蛋白的添加量为：以蛋白质量计，PU降解体系中蛋白浓度为底物浓度的10-20wt％。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述粗酶液或纯化蛋白的添加量为：以蛋白质量计，PU降解体系中蛋白浓度为底物浓度的15wt％。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白，为如下1)-8)中任一种：
2.编码权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组质粒。
4.权利要求1所述蛋白在如下a)和b)中至少一种中的应用：
5.权利要求2所述核酸分子在如下a)和b)中至少一种中的应用：
6.权利要求3所述重组载体或重组菌在如下a)和b)中至少一种中的应用：
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述聚醚型pu和聚酯型p...
【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，温源，姜岷，刘嘉唯，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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