本发明专利技术属于生物技术领域，具体是一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，首先对系列酶基因进行扩增，分别构建由ｐＧＡＰ调控的酿酒酵母表达载体，并转化为酿酒酵母基因组；经验证、筛选后得到酿酒酵母工程菌；将植物或植物废弃物于高温下用稀酸进行浸泡预处理后，应用所构建的酿酒酵母工程菌于２８－３０℃进行发酵生产乙醇。本发明专利技术采用了在构建酿酒酵母工程菌的同时进行同步糖化、转化的方法，省略了传统工艺中需要生产的系列酶的过程，在较大的程度上降低乙醇的生产成本，有利于大规模利用植物及其植物废弃物的纤维素和半纤维素生产乙醇。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种将葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、P-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、 L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶重组于酿酒酵母基因组，然后利用酿酒酵母基因组，以 植物的纤维素和半纤维素为原料生产乙醇的方法。
技术介绍
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常应用的酒精生产菌，但是它只有 代谢葡萄糖生成乙醇的酶系。目前利用植物纤维素是先加入系列纤维素酶使纤维素分解 生成葡萄糖，然后再应用酿酒酵母菌的代谢作用将葡萄糖转化生成乙醇。植物材料中约含 20-30X的半纤维素，半纤维素主要由D-木糖和L-阿拉伯糖(L-树胶醛糖)组成，在系列酶 的作用下D-木糖和L-阿拉伯糖能转化为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛，然后再应用酿 酒酵母菌的代谢作用将6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛转化生成乙醇。但是系列纤维素酶 (葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和P-葡萄糖苷酶)转化木糖和阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖 或3-磷酸甘油醛所需的系列的酶(转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶丄-核 酮糖_5-磷酸-4-差向异构酶丄-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶)的生产需要消耗大量 的人力、物力和能源，使目前纤维素和半纤维素乙醇的生产成本过高，从而制约了利用植物 及其植物的废弃物的纤维素和半纤维素生产乙醇产业的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决在利用植物物质的纤维素和半纤维素生产乙醇过程中，需添 加的酶的生产成本高，使纤维素乙醇和半纤维素乙醇的生产成本高的问题，为植物的纤维 素和半纤维素生产乙醇提供一种用酿酒酵母工程菌同步糖化纤维素生产乙醇和同步转化 D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素的主要成分)生产乙醇的方法。 本专利技术所采用的技术方案 —种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其步骤如下 1、从里氏木霉(Trichoderma ressiei)基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切 酶和P-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、 木酮糖激酶丄-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶丄-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因； 2、分别构建由pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外 切酶和P _葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶丄_核酮糖-5-磷 酸_4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些 载体转化酿酒酵母基因组(重组子)； 3、用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切 酶、P _葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷 酸_4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模版，进行PCR扩增；根据宿主菌没有 扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基 因是已经重组于重组子的基因组； 4、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出1. 2 /ml以上的酿酒酵母为工程 菌； 5、将植物或植物废弃物于160 30(TC的温度下用0. 1% 3%的酸溶液(pH< 1) 进行浸泡处理，分解得到木质素，并分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预 处理水解生成D-木糖和L-阿拉伯糖)；所述酸是盐酸、硫酸或磷酸。 6、以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒 酵母工程菌于28 3(TC进行发酵生产乙醇。 本专利技术采用了直接利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，本专利技术的优点在 于 由于采用了同步糖化纤维素生成葡萄糖和将葡萄糖酵解生成酒精，以及同步转化 构成半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛而进行酵解生 成乙醇的方法，省略了需要生产成本高的系列纤维素酶(葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和 P _葡萄糖苷酶)和转化木糖和阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛系列的酶(转 醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶丄_核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶丄-树胶 醛糖异构酶和L核酮糖激酶)的生产，能够在较大的程度上降低利用植物纤维素和半纤维 素生产乙醇的成本。具体实施例方式下面才用非限定性实施例对本专利技术作进一步说明。 1.从里氏木霉(Trichoderma ressiei)基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切 酶和P-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、 木酮糖激酶丄-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶丄-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因。 2.分别构建由pGAP调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和13 -葡萄糖苷酶、转醛醇 酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶丄_核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶丄-树胶醛糖 异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组； 3.用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切 酶、P _葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷 酸_4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没 有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模版，进行PCR扩增；根据宿主菌没有 扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基 因是已经重组于重组子的基因组。 4.用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出1. 2 ii /ml以上的酿酒酵母为工程 菌。 5.将植物茎叶于280°C的温度下用0. 3%的硫酸溶液进行浸泡处理，使分解木质 素，分离出纤维素卬-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿拉 伯糖)。 6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒 酵母工程菌于2『C进行发酵生产乙醇。 实施例二 本实施例的第一、第二、第三、第四步骤与实施例一相同。 5.将植物废弃物于210°C的温度下用1. 8%的盐酸溶液进行浸泡处理，使分解木 质素，分离出纤维素卬-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿 拉伯糖)。 6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒 酵母工程菌于3(TC进行发酵生产乙醇。 实施例三 本实施例的第一、第二、第三、第四步骤与实施例一相同。 5.将植物废弃物于180°C的温度下用2. 7 %的磷酸溶液进行浸泡处理，使分解木 质素，分离出纤维素卬-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿 拉伯糖)。 6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒 酵母工程菌于3(TC进行发酵生产乙醇。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其特征在于，其步骤如下： １）、从里氏木霉基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β－葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、Ｌ－核酮糖－５－磷酸－４－差向异构酶、Ｌ－树胶醛糖异构酶和Ｌ核酮糖激酶基因； ２）、分别构建由ｐＧＡＰ调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β－葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、Ｌ－核酮糖－５－磷酸－４－差向异构酶、Ｌ－树胶醛糖异构酶、Ｌ核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组； ３）、用ＰＣＲ方法扩增目标基因验证重组子：分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β－葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、Ｌ－核酮糖－５－磷酸－４－差向异构酶、Ｌ－树胶醛糖异构酶、Ｌ核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母基因组ＤＮＡ为模版，进行ＰＣＲ扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的ＰＣＲ扩增带而重组子能扩增出目标大小的ＰＣＲ扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组； ４）、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出１．２μ／ｍｌ以上的酿酒酵母为工程菌； ５）、将植物或植物废弃物于１６０～３００℃的温度下用０．１％～３％的酸溶液进行浸泡处理，分解得到木质素，并分离出纤维素、Ｄ－木糖和Ｌ－阿拉伯糖； ６）、以纤维素和来自半纤维素的Ｄ－木糖和Ｌ－阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于２８～３０℃进行发酵生产乙醇。...
【技术特征摘要】
一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其特征在于，其步骤如下1)、从里氏木霉基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因；2)、分别构建由pGAP调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组；3)、用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构...
【专利技术属性】
技术研发人员：张爱联，屠发志，易国辉，屈直，张添元，罗进贤，崔艳艳，张泽华，马德勇，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]
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