【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种单分子免疫检测方法。
技术介绍
1、单分子免疫检测是蛋白生物标志物检测领域的颠覆性新技术，是指通过免疫标记的方法，利用抗体捕获和识别抗原，进行信号分子标记或是酶联标记的形式，通过单分子荧光信号检测或单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测，其检测灵敏度是elisa（酶联免疫吸附法）的1000倍。
2、现有的单分子免疫检测方法主要分为三类，第一类是以流通池（也称flowcell或鞘流池）为反应待检测液体的检测载体做检测，比如苏州宇测生物ast-dx90系统的检测方法。这种方式的确实可以实现检测，但问题也很明显，每次在流通池检测完之后需要多次清洗，检测通量必然不高，更致命的是重复使用带来的携带污染无法避免，这对于高灵敏度为核心优势的仪器来说是个严重问题。第二类是利用纳米孔技术来实现单分子免疫检测。比如quanterix公司的simoa系统的检测方法，其通过采用纳米孔技术，将约250,000个捕获抗体包被在2.7μm的小磁珠上，检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过一层油将单个磁珠分别封闭在238,000个4.5μm的反应孔（well）中进行反应，然后通过ccd检测。但纳米孔技术对加工精度和检测成本都是极大的挑战，很难大量商业使用。第三类是merck的smc系统的检测方法，smc采取的是更为直接的通过激光聚焦的形式提高免疫标记的少数几个荧光染料分子的光子产量，来实现单分子的计数检测。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线。通过对一定
3、有鉴于此，目前关于单分子免疫检测的方法皆存在一定的缺点，因此，开发出一种简便、成本低、易实现、经济实用的单分子免疫检测方法，对于单分子免疫检测领域具有很重要的实际意义。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在问题与不足，本专利技术提供一种单分子免疫检测方法，该方法采用一次性反应杯作为反应待检测液体的检测载体，能有效避免清洗带来的通量不高和携带污染问题。同时该方法通过根据不同反应杯特点搭配不同的分析仪器（每个不同的分析仪器对应不同的光学检测模块），可以实现在不用反复对不同反应杯进行调焦的情况下，对反应杯底部磁珠+荧光微球双球体系的平铺拍照，进而实现单分子免疫的极微量检测。该方法操作简单，无需一些复杂的加工过程或者极限的光源条件，成本较低，且不同反应杯之间无需进行重复调焦，极大节省了检测时间，加快了检测速度。
2、本专利技术提供一种单分子免疫检测方法，包括如下步骤：s1.在反应杯中依次加入检测样本、磁珠试剂、荧光微球试剂，将所得到的第一混合液进行恒温孵育，得到第二混合液；检测样本含有抗原，磁珠试剂中，磁珠表面偶联有抗体一，荧光微球试剂中，荧光微球表面偶联有抗体二，抗原与抗体一、抗体二发生特异性免疫反应；第二混合液中含有磁珠-抗原-荧光微球；s2.利用磁分离的方法去除第二混合液中未进行特异性免疫反应的荧光微球，接着加入缓冲液或清水使磁珠-抗原-荧光微球重新悬浮，得到第三混合液；s3.将含有第三混合液的反应杯进行磁吸，使磁珠-抗原-荧光微球平铺处于同一平面，接着利用分析仪器中的光学检测模块进行荧光拍照，对所得照片进行分析、处理，得到检测结果；反应杯为一次性反应杯，不同反应杯之间的最大尺寸公差为d，d=±n1，n1为最大尺寸公差的绝对值，0<n1≤0.1mm；光学检测模块包括物镜、成像系统，成像系统的景深为df，df≤n1，根据物镜与不同反应杯成像的距离不同，将光学仪器进行分类，分类的数量为n2，n2≥2n1/df，n2取整数；在对反应杯进行荧光拍照的过程中，根据反应杯的尺寸公差情况，匹配适合的光学仪器对反应杯进行荧光拍照，不同反应杯进行荧光拍照时，不需要重新调焦。
3、首先，经过s1中的恒温孵育，样本中的抗原能与磁珠表面抗体一、荧光微球表面抗体二发生特异性抗原-抗体免疫反应，形成磁珠（抗体一）-抗原-荧光微球（抗体二）。接着进行s2中的磁分离操作后，未发生特异性抗原-抗体免疫反应的荧光微球就会被除去，而剩下的磁珠-抗原-荧光微球在s3中经过磁吸后在反应杯的底部平铺，处于同一平面，使得在后续进行荧光拍照的时候，能够较为完整、全面地拍摄到所有发生荧光的荧光微球发光点（磁珠不会发光），提高极微量单分子免疫检测的准确度。这里需说明的是，在步骤s2中，也可能会有一部分未参与反应的磁珠，该部分磁珠在s3中与双抗夹心磁珠-抗原-荧光微球一起在反应杯底部平铺。
4、本专利技术所提供的单分子免疫检测方法的亮点在于，其不仅是通过采用一次性反应杯作为反应待测液体的检测载体，能够有效避免清洗带来的通量不高和携带污染等问题，而且在利用含有一定尺寸公差的不同反应杯进行多次检测的时候，在对不同反应杯进行荧光拍照的时候，是不需要重新调焦的，大大提高了检测速度，即提高了检测通量。
5、而现有技术中，若是采用一次性反应杯作为反应待测液体的检测载体，因为不同的一次性反应杯之间总是一些微小的差异，如前面提及的尺寸公差，这样会导致一个问题，在测完一个样本后继续测下一个样本时，需要根据反应杯的情况进行重新调焦，否则成像系统画面模糊，拍照不清晰，影响后面对照片的分析、处理而影响检测结果。为了解决这个问题，首先，本专利技术通过严格控制生产一次性反应杯的反应条件（控制每次注塑的压力、温度等注塑关键参数保持一致）以及注塑模具的尺寸公差，使注塑模具中同一个穴位或者不同穴位生产出来的反应杯（为了加快生产速度，一般模具上有复数个尺寸公差较小的穴位）之间的尺寸公差在较小的范围内，这样既能保证不同反应杯之间的尺寸公差较小，又不会使加工成本过于高昂。其次，因为成像系统的景深往往是不高于不同反应杯之间的最大尺寸公差的，成像系统的景深可以将反应杯的最大尺寸公差分割为数个脱焦范围。由此，本专利技术通过根据不同反应杯与物镜的成像距离不同，且根据特定的公式设置数个不同的分析仪器（不同的分析仪器是以不同的光学检测模块为分类），这样使得整套设备成像系统的景深能够涵盖所有不同反应杯。因此可以根据反应杯具体的尺寸情况来自动匹配成像距离合适的含有特定光学检测模块的分析仪器，使得在对不同反应杯进行荧光拍照的时候，能够不进行重新调焦即可进行清楚的荧光拍照，大大提高了检测速度，即提高检测通量。判断反应杯具体的尺寸情况，可以根据注塑模具的尺寸情况来判定，因为在注塑过程中完全保证每一次的注塑条件严格一致，因此同一个穴位生产的不同反应杯尺寸公差很小，可以忽略不计，同一个穴位生产的不同反应杯可以互换使用。而不同穴位生产的反应杯，可直接根据不同穴位的尺寸公差情况判断不同穴位生产的反应杯的尺寸公差情况即可。且在利用反应杯尺寸公差情况判断合适的分析仪本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单分子免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述检测样本、所述磁珠试剂、所述荧光微球试剂的体积比为10~14:45~55:90~110。
3.如权利要求2所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述磁珠试剂的浓度为0.05~0.30mg/L，所述荧光微球试剂的浓度为0.10~0.5mg/L。
4.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为100~1000nm；所述荧光微球的粒径为0.5~5μm。
5.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：在所述S1中，恒温孵育的条件为，在37±0.5℃的温度下，孵育7~10min。
6.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述成像系统为CCD成像系统。
7.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：在所述S2中，磁分离的具体操作如下：将含所述第二混合液的所述反应杯转移至磁吸工位，利用磁铁对所述反应杯进行磁铁吸附，吸附时间不低于10s。
8.如权利要求1所述
9.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述光学检测模块还包括激发光源、滤光片。
10.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于，在所述S3中，对所述照片进行分析、处理的具体操作如下：
...【技术特征摘要】
1.一种单分子免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述检测样本、所述磁珠试剂、所述荧光微球试剂的体积比为10~14:45~55:90~110。
3.如权利要求2所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述磁珠试剂的浓度为0.05~0.30mg/l，所述荧光微球试剂的浓度为0.10~0.5mg/l。
4.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为100~1000nm；所述荧光微球的粒径为0.5~5μm。
5.如权利要求1所述单分子免疫检测方法，其特征在于：在所述s1中，恒温孵育的条件为，在37±0.5℃的温度下，孵育7~10min。
6.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：林清璇，何皓，米超，
申请(专利权)人：深圳市光与生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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