【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程，涉及源自食用真菌茯苓的活性pcp蛋白基因及其重组载体、重组蛋白。
技术介绍
1、在活体试验中大型真菌都显示了免疫调节、抗病毒和降低胆固醇等活性，这些活性都是通过调控免疫系统起作用的。大型真菌的生物学活性化合物主要包括多糖、多糖肽、多糖蛋白、蛋白聚糖和蛋白等。目前全世界有数百种药用真菌凝集素被分离和纯化，具有很大的研究价值。真菌免疫调节蛋白(fip)是继凝集素之后在大型真菌蘑菇中发现的另一类具有免疫调节和抗肿瘤活性的小分子蛋白。该类蛋白通过作用于免疫效应细胞，激发肌体先天或获得性免疫应答，诱导生物学效应物合成来行使其免疫调节和抗肿瘤功能。
2、茯苓中蛋白质约占茯苓药重的1.5％。从茯苓菌核中纯化得到一种茯苓免疫调节蛋白(pcp)，体外试验显示该pcp能刺激raw 264.7巨噬细胞产生tnf-α与il-1β，同时亦能调控nf-κb相关基因的表达量。可见该真菌免疫调节蛋白fip具有活化免疫的功能，具有重要的应用开发价值。
3、从食用菌中提取天然fips，成本昂贵、耗时、产量少，每千克蘑菇只能提取毫克级蛋白。1997年hsu等从3kg草菇子实体中提纯fip-vvo，最终获得蛋白质仅90余毫克，且蛋白纯化的步骤繁杂，成本高昂。因此，从食用或药用菌中直接提取很难获得大量且价廉的fips，严重制约了其在临床和医药上的应用。因此，研究和建立高产稳定的fips重组表达体系，成为必然的选择。现代分子生物学和生物工程技术的迅速发展，为利用工程菌株获得大量重组免疫调节蛋白提供了技术基础。大肠杆菌系统
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种茯苓活性蛋白pcp重组基因、蛋白及其包含活性蛋白pcp蛋白的基因的重组表达载体。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1.本专利技术提供基因，为编码活性蛋白pcp蛋白的基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：
4、1)序列表中seq id no.1的核苷酸序列；
5、2)与seq id no.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
6、进一步，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：序列表中seq idno.1、seq id no.8、seq id no.9的核苷酸序列。
7、2.本专利技术还提供一种重组活性pcp蛋白，所述重组活性pcp蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：
8、(1)由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
9、(2)将序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由seq id no.2衍生的蛋白质。
10、其中，序列表中的seq id no.2由126个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含390个核苷酸，其中包括一个由6个组氨酸残基组成的标签和一个不编码任何氨其酸的终止密码子taa。
11、所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
12、3.含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本专利技术的保护范围。
13、4.一种克隆载体，含有序列表中seq id no.1、seq id no.8、seq id no.9的核苷酸序列。
14、5.一种重组表达载体，含有序列表中seq id no.1、seq id no.8、seq id no.9的核苷酸序列。
15、进一步，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因序列如seq idno.1、seq id no.8或seq id no.9所示，所述空载体为ppiczαa、ppic9k等分泌表达载体。
16、6.重组表达载体的制备方法，具体步骤包括：
17、(1)用xho i和xba i双酶切含pcp蛋白基因的质粒，获得目的片断；
18、(2)用xho i和xba i双酶切表达载体，获得酶切载体；
19、(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和表达载体用dna凝胶进行回收；
20、(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和酶切载体用t4dna连接酶进行连接反应，目的基因片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内。
21、进一步，步骤1)中双酶切反应体系：含pcp蛋白基因的质粒15μl，10×m缓冲液5μl，xho i 5u，xba i 5u，加无菌水至50μl；步骤2)中双酶切反应体系：表达载体15μl，10×m缓冲液5μl，xho i 5u，xba i 5u，加无菌水至50μl。
22、进一步，连接反应的反应体系如下：酶切载体1μl，目的片段3μl，10×缓冲液1μl，t4连接酶0.5μl，加无菌水至10μl。
23、本专利技术提供的技术方案具有以下优点：本专利技术不断优化核苷酸序列，利用所提供的seq id no.1所示的基因构建了重组质粒、重组载体，可转化至毕赤酵母得到重组菌，利用重组菌发酵就能实现目标蛋白的高水平重组分泌表达。为真菌免疫调节蛋白fip的市场应用奠定了坚实的基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种活性PCP蛋白基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：
2.根据权利要求1所述的活性PCP蛋白基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因编码得到的重组活性PCP蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组活性PCP蛋白，其特征在于：所述重组活性PCP蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：
5.一种克隆载体，其特征在于，含有权利要求1或权利要求2所述基因。
6.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1或权利要求2所述基因。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求1所述的基因，所述空载体为pPICZαA、pPIC9K等分泌表达载体。
8.权利要求6所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
9.权利要求8所述的重组表达载体的制
10.权利要求8所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，连接反应的反应体系如下：
...【技术特征摘要】
1.一种活性pcp蛋白基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：
2.根据权利要求1所述的活性pcp蛋白基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：序列表中seq id no.1、seq id no.8、seq id no.9的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因编码得到的重组活性pcp蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组活性pcp蛋白，其特征在于：所述重组活性pcp蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：
5.一种克隆载体，其特征在于，含有权利要求1或权利要求2所述基因。
6.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1或权利要求2所述基因。
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