【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测技术。更具体地，涉及一种灵敏度高的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、在科研与应用过程中，当待检测细胞或者生物学过程缺少可被直接检测的指示物，但待检测物的下游可以表达特异性的转录因子相关组件时，此时将转录因子对应调控的转录相关元件如启动子区dna和报告基因序列偶联一同转入待检测细胞，建立报告基因细胞系。通常报告基因会选择可以被准确检测的荧光蛋白质或酶，检测荧光蛋白表达量或通过检测酶参与的反应产物等作为指示物来反应待测细胞或生物学过程的活性，常用的报告基因有：氯霉素乙酰转移酶(cat)，β半乳糖苷酶(β-gal或lacz)，萤光素酶(luciferase)以及egfp等荧光蛋白。其中萤光素酶报告基因具有检测便捷、灵敏度高、线性范围宽、可以进行活细胞和活体检测等优点，使用非常广泛。
2、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)作为一种常见的报告基因所选取的酶，其可以催化底物荧光素(luciferin)进行氧化，在氧化过程中，荧光素底物发出波长在560nm附近的生物荧光，通过荧光测定仪精准测定荧光值，进而准确定量萤火虫荧光素酶表达量。通过荧光素酶-荧光素这一反应体系可以灵敏高效的测定荧光素酶蛋白表达水平，进而反映出调控其表达的转录因子与启动子区dna结合的相互作用程度，进一步反映上游生物学过程的活性。萤火虫荧光素酶作为一种胞浆蛋白，需要通过细胞裂解将荧光素酶释放出来，再接触到底物发生反应。在荧光素酶-荧光素这一反应过程中，需要氧气进行氧化，三磷酸腺苷来提供反应能量，
3、利用这一反应原理开发出荧光素酶报告基因系统，目前常应用于多种表达元件调控功能的验证实验，既可以用于检测反式作用因子(trans-element)如转录因子等的活性，也可以用于检测顺式作用因子(cis-element)，如启动子转录活性，转录因子结合位点验证，microrna结合位点验证，5’utr和3’utr功能验证，增强子/沉默子功能验证，效应元件功能验证等。借由此基因表达调控验证相关实验，可以更深入更广泛的运用到抗体药等生物药相关开发与生产质控领域中，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)作用实验，可实现大规模、高准确性、高效率的生物活性检测，可面向包括科研、生产等诸多侧重方面，具有广阔的应用实景和应用深度。
4、对于一些微量表达萤火虫荧光素酶报告基因的实验体系，目前的试剂盒面临的问题是可检测到的荧光信号很弱，荧光信号值偏低，无法灵敏检测，易出现假阴性结果，不能分析出有效的结论。因此，需要更灵敏的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂，以防止假阴性的结果出现造成重要结论的丢失。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒及应用，该试剂盒在保证检测信号稳定性的前提下，提高信号值和信号窗口值，最终达到提高荧光素酶检测灵敏度的效果。
2、为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
3、本专利技术首先提供了一种灵敏度高的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，包括缓冲液与检测底物；
4、其中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、甘油、表面活性剂、离子螯合剂、二价金属离子、三磷酸腺苷、还原剂、辅酶a、组氨酸和牛血清白蛋白；所述检测底物包括d-荧光素。
5、在本专利技术中对萤火虫荧光素酶报告基因检测需要缓冲液与检测底物共同加入，缓冲液提供反应的环境，检测底物提供荧光素，萤火虫萤光素酶催化氧化荧光素，发出可被检测的荧光，具体反应式如下：
6、
7、进一步，所述三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为50-200mm，优选为150mm。
8、进一步，所述甘油在缓冲液中的浓度为1％-20％，优选为20％。
9、进一步，所述表面活性剂为吐温20和曲拉通100中任意一种，优选为吐温20，在缓冲液中的浓度为1％-10％，优选为5％。
10、进一步，所述离子螯合剂为乙二胺四乙酸、1,2-环己二胺四乙酸、氨基三乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中任意一种，优选为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，在缓冲液中的浓度为5mm-20mm，优选为6mm。
11、进一步，所述二价金属离子为ca2+、mn2+、mg2+、zn2+和cu2+中任意一种，优选为mg2+，在缓冲液中的浓度为5mm-15mm，优选为8mm。
12、进一步，所述三磷酸腺苷在缓冲液中的浓度为0.01mm-1mm，优选为0.05mm。
13、进一步，所述还原剂为二硫苏糖醇，在缓冲液中的浓度为1mm-20mm，优选为2mm。
14、进一步，所述辅酶a在缓冲液中的浓度为0.01-0.1mm，优选为0.03mm。
15、进一步，所述组氨酸在缓冲液中的浓度为1-5mm，优选为3.3mm。
16、进一步，所述牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.1％-2％，优选为0.5％。
17、进一步，所述d-荧光素的使用终浓度为4mm-10mm，优选为6mm。
18、本专利技术进一步提供了上述萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒在如下任一所述的应用：
19、1)在提高萤火虫荧光素酶报告基因检测灵敏度中的应用；
20、2)在抗体药的adcc体系生物活性检测中的应用。
21、本专利技术中抗体药生物活性检测是通过萤火虫荧光素酶报告基因检测实现的。在本专利技术具体的实施方式中，所述抗体药的adcc体系生物活性检测方法包括如下步骤：
22、将靶细胞、抗体药以及效应细胞进行铺板，孵育，得到待检测细胞样品培养板；
23、将上述萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒中缓冲液进行溶解并平衡至室温，颠倒混匀后加于检测底物中，颠倒混匀彻底溶解检测底物，得到检测液；将待检测细胞样品培养板平衡至室温，加入与待检测细胞样品相同体积的检测液，震荡，彻底裂解细胞，使用带有化学发光检测模块的酶标仪测量发光信号值。
24、在本专利技术优选的实施方式中，所述抗体药的adcc体系生物活性检测包括如下步骤：
25、1)构建模拟效应细胞
26、构建表达fcγiiia(v158)和nfat-luc报告基因的jurkat细胞，即模拟效应细胞fcγiiia(v158)-luci jurkat；
27、2)细胞铺板与孵育
28、将靶细胞、抗体药以及模拟效应细胞以合适的比例进行铺板，其中，raji细胞(靶细胞)为8e5个/孔，模拟效应细胞fcγiiia(v158)-luci jurkat为2e5个/孔，抗体药(利妥昔单抗)浓度为0.00005μg/ml，0.0001μg/ml，0.0005μg/ml，0.001μg/ml，0.005μg/ml，0.01μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2.5μg/ml，整体孵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，包括缓冲液与检测底物；
2.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇；
3.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为50-200mM，优选为150mM；
4.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20和曲拉通100中任意一种，优选为吐温20，更优选的，在缓冲液中的浓度为1％-10％，最优选为5％。
5.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂为乙二胺四乙酸、1,2-环己二胺四乙酸、氨基三乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中任意一种，优选为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，在缓冲液中的浓度为5mM-20mM，优选为6mM。
6.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述三磷酸腺苷在缓冲液中的浓度为0.01mM-1mM，优选为0.05mM；
7.根据权
8.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述D-荧光素的使用终浓度为4mM-10mM，优选为6mM。
9.权利要求1-8任一所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒在如下任一所述的应用：
10.一种抗体药的ADCC体系生物活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，包括缓冲液与检测底物；
2.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇；
3.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为50-200mm，优选为150mm；
4.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20和曲拉通100中任意一种，优选为吐温20，更优选的，在缓冲液中的浓度为1％-10％，最优选为5％。
5.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂为乙二胺四乙酸、1,2-环己二胺四乙酸、氨基三乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中任意一种，优选为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，在...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙艺洋，付丽娜，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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