【技术实现步骤摘要】
本申请属于化学加成反应和测序领域，更具体地，涉及一种检测rna上异戊烯基腺苷修饰的方法。
技术介绍
1、rna的转录后修饰在翻译过程具有重要作用。当前研究显示，rna上异戊烯基腺苷(i6a)修饰在物种中存在十分保守，从低等的细菌到高等的哺乳动物中均存在该修饰。目前仅在trna第37位发现天然存在的异戊烯基腺苷，i6a修饰参与调控翻译的保真度、翻译的速度和无义抑制等有关过程。
2、截至目前，已报导的关于i6a修饰的检测方法仅有i6a抗体免疫识别(p.senapathy,1981；jerry r.faust,1991)和最近新开发的pham(positive hybridization in theabsence of modification)rna免疫印迹方法(richard j.maraia,2022)，但这两种方法均存在局限。前者只能全局范围内检测i6a修饰水平，无法识别具体携带i6a修饰的trna种类，且目前市场上并无适用所有于物种中i6a修饰检测的商品化抗体，即使在实验室级别也只能用于识别哺乳动物细胞和酵母。pham法是一种基于修饰缺失的正交rna免疫印迹方法，该方法检测i6a修饰需要使用两个探针(acl probe和body probe)同时检测，不同种类的trna需合成设计多种不同的探针，同时需要测试探针的最佳杂交条件，因此该方法每次只能检测一种trna，一般常用于验证已报道的含有i6a修饰的trna种类。因此在生物种类及trna种类上的普适性较弱，在检测通量和精度上均存在局限性。
1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本申请提供了一种检测rna上异戊烯基腺苷修饰的方法，其目的在于提供一种适用性更广的i6a修饰的检测方法。
2、按照本专利技术的一个方面，提供了一种检测rna上异戊烯基腺苷修饰的方法，用碘单质与rna的异戊烯基腺苷基团的双键进行加成反应，然后对加成反应后的rna的目标位点进行测序，在加成反应后突变率上升的目标位点即为异戊烯基腺苷修饰的位点。
3、优选地，所述加成反应具体包括以下步骤：
4、(1)在rna的反应溶液中加入相当于rna的摩尔质量1.0～20.0倍的碘单质，0℃～37℃温度下反应1～60分钟，与修饰于腺嘌呤上的异戊烯基腺苷基团的双键进行加成反应；
5、(2)在反应溶液中加入相当于步骤(1)中碘单质的摩尔质量3.0倍以上的s2o32-离子，以中和步骤(1)中反应剩余的碘单质；
6、(3)调节反应溶液的ph值至7.0～7.4，以抑制rna的降解，获得加成反应后的rna。
7、作为进一步优选地，在所述步骤(1)中加入所述碘单质的方法为加入0.1m～1.0m的碘溶液。
8、作为进一步优选地，在所述步骤(2)中加入所述s2o32-离子的方法为加入质量分数为5％以上的硫代硫酸盐溶液。
9、作为进一步优选地，所述步骤(3)中所述调节反应溶液的ph的方法为在反应溶液中加入相当于步骤(2)中s2o32-离子的摩尔质量1.0倍以上的碳酸盐、碳酸氢盐或醋酸盐。
10、作为更进一步优选地，在所述步骤(3)中的加入的所述碳酸盐为质量分数为5.0％以上的碳酸钠或碳酸钾；所述碳酸氢盐为质量分数为5.0％以上的碳酸氢钠或碳酸氢钾，所述醋酸盐为质量分数为5.0％以上的醋酸钠或醋酸钾。
11、优选地，所述rna为转运rna。
12、优选地，所述目标位点为rna的第37位或rna的全序列位点。
13、优选地，所述rna为多个。
14、优选地，所述突变率上升的评价标准为，通过计算突变评分score是否大于阈值，判断所述目标位点是否为异戊烯基腺苷修饰的位点；
15、其中，所述突变评分为其中，mt为加成反应后的rna的目标位点的突变率，mc为未发生加成反应的rna的目标位点的突变率；ф为平滑系数，为0.01以下的正数。
16、作为进一步优选地，所述阈值为1，所述平滑系数ф＝0.001。
17、优选地，所述对加成反应后的rna的目标位点进行测序的方法为，先将加成反应后的rna回收进行逆转录获得cdna，再对cdna进行测序。
18、总体而言，本申请通过碘单质与异戊烯基腺苷基团的双键进行加成反应，进而检测加成反应后的rna的突变率，在无需针对不同rna设计探针的前提下，即可检测不同物种及不同类型的rna中的i6a修饰，可以实现对内源i6a修饰水平的定量及修饰位点的鉴定，极大地提高了检测效率及检测通量，同时也有效避开了物种及rna种类特异性实现从头检测i6a修饰。
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1.一种检测RNA上异戊烯基腺苷修饰的方法，其特征在于，用碘单质与RNA的异戊烯基腺苷基团的双键进行加成反应，然后对加成反应后的RNA的目标位点进行测序，在加成反应后突变率上升的目标位点即为异戊烯基腺苷修饰的位点。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加成反应具体包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中加入所述碘单质的方法为加入0.1M～1.0M的碘溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中加入所述S2O32-离子的方法为加入质量分数为5％以上的硫代硫酸盐溶液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述调节反应溶液的pH的方法为在反应溶液中加入相当于步骤(2)中S2O32-离子的摩尔质量1.0倍以上的碳酸盐、碳酸氢盐或醋酸盐。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA为转运RNA。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标位点为RNA的第37位。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变率上升的评价标准为，通过计算突变评分Score是否大于阈值，判断所述目标位点是否为异戊烯基腺苷修饰的位点；
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述阈值为1，所述平滑系数Ф＝0.001。
...【技术特征摘要】
1.一种检测rna上异戊烯基腺苷修饰的方法，其特征在于，用碘单质与rna的异戊烯基腺苷基团的双键进行加成反应，然后对加成反应后的rna的目标位点进行测序，在加成反应后突变率上升的目标位点即为异戊烯基腺苷修饰的位点。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加成反应具体包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中加入所述碘单质的方法为加入0.1m～1.0m的碘溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中加入所述s2o32-离子的方法为加入质量分数为5％以上的硫代硫酸盐溶液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述调...
【专利技术属性】
技术研发人员：周志鹏，王锐，陈莎莎，李益楠，郭宇扬，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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