人工改造脱氨酶辅助的DNA中胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中特定位点胞嘧啶、5‑甲基胞嘧啶和5‑羟甲基胞嘧啶同时定量分析方法，属于生物技术领域。本发明专利技术利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3A‑M1蛋白实现对DNA中胞嘧啶(C)完全脱氨基、对5‑甲基胞嘧啶(5mC)部分脱氨基、对5‑羟甲基胞嘧啶(5hmC)不脱氨基，随后进行PCR扩增并对扩增产物测序获得5mC的脱氨基率和待测位点的整体脱氨基率，并通过计算直接获得待测位点C、5mC和5hmC的含量信息。本发明专利技术方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理且无需其他生物酶介导，可以直接获得DNA中特定位点C、5mC和5hmC的定量信息。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，具体涉及一种人工改造脱氨酶辅助的dna中特定位点胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰同时定量分析方法。

技术介绍

1、5-甲基胞嘧啶(5mc)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)是哺乳动物dna中重要的表观遗传修饰。在哺乳动物中，十-十一转座酶(tet)蛋白将5mc嘧啶环第5位碳原子上的甲基氧化成羟甲基，形成5hmc。5mc约占胞嘧啶的1～3％，5hmc约占胞嘧啶的0.1～0.3％，且几乎所有的5mc和5hmc都存在于cpg二核苷酸中。已有大量事实证明，5mc和5hmc参与调控了染色体重塑、基因表达调控、细胞分化以及疾病发生和发展等等复杂的生物过程。此外，5mc和5hmc可以被tet蛋白逐步氧化为5-醛基胞嘧啶(5fc)和5-羧基胞嘧啶(5cac)，形成新的修饰。基于5mc和5hmc在一系列生理过程中的重要地位和发挥的关键作用，它们分别被称为dna中的“第五碱基”和“第六碱基”。迄今为止，对于5mc和5hmc修饰的功能研究一直是核酸表观遗传学的研究热点。为了揭示该修饰精准的生物学功能，则需要依赖于高准确度的定位和定量分析方法。

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【技术保护点】

1.一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在胞嘧啶脱氨中的应用，其特征在于：所述的胞嘧啶为C和/或5mC。

3.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在检测C、5mC和/或5hmC中的应用，其特征在于：所述检测包括定位检测、定量检测。

4.一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5mC和5hmC修饰定位分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

5.一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中特定位点C、5mC和5hmC同时定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

6.根据权利要求4或5...

【技术特征摘要】

1.一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在胞嘧啶脱氨中的应用，其特征在于：所述的胞嘧啶为c和/或5mc。

3.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在检测c、5mc和/或5hmc中的应用，其特征在于：所述检测包括定位检测、定量检测。

4.一种人工改造脱氨酶辅助的dna中5mc和5hmc修饰定位分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

5.一种人工改造脱氨酶辅助的dna中特定位点c、5mc和5hmc同时定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：dna变性处理的方法为：将dna在90～95℃高...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁必锋，谢能彬，王敏，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：