一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段DNA转移中的应用技术

本发明专利技术提供了一种将二倍体宿主向单倍体转变的方法及其在大片段DNA转移中的应用。该方法利用CRISPR/Cas9系统、着丝粒附近产生DSB诱导整条染色体删除技术以及URA3/5‑FOA反筛系统，实现了一次性多靶点地快速消除酵母16条染色体，从而在二倍体酵母中选择性消除一套基因组，最终保留另一套染色体，得到单倍体酵母，进一步基于该方法实现了1.024Mb DNA片段的转移。该方法具有操作简单、周期短、成本低的特点，有望为含有着丝粒型染色体的其他酵母等真核微生物及动植物提供实现快速单倍体化的便捷途径，在生物育种等方面具有广泛的应用潜力，亦可用于其他定制化多条染色体删除的非整倍体细胞构建和大片段DNA的转移。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，尤其涉及将一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用。

技术介绍

1、现有技术报道的获得酵母单倍体的方法是：将交配型为a和α的两种酿酒酵母在培养基中进行自发交配，形成携带两套基因组的二倍体，之后二倍体酵母将进行减数分裂，生成孢子。然后通过物理或化学的方法人为地将孢子拆分成四个各携带一套基因组的单倍体孢子。从两个不同的单倍体酵母株开始培养二倍体酵母，培养条件通常是富含氮源的培养基，需要1-2天的时间。之后诱导孢子形成，将二倍体酵母细胞转移到缺乏氮源的培养基中，刺激孢子形成途径的启动，需要7天的时间。检测孢子形成后进行提取，需要数天至一周的时间。综上，这个过程从酿酒酵母交配到拆分得到单倍体持续9天，时间周期长，操作繁琐。

2、目前，拆孢主要采用的化学方法和物理方法，除了上述时间周期长和操作繁琐的共性问题，各自还存在一些其他的缺点，具体过程和缺点如下：

3、(1)酶处理法

4、做法：使用酵母胰蛋白酶或zymolyase等酶，对细胞壁进行水解，有选择性地破坏特定的结构。

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【技术保护点】

1.一种快速将二倍体宿主转变为单倍体宿主的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二倍体宿主为含有着丝粒的微生物或动物细胞；所述含有着丝粒的微生物包括酵母或原生动物；所述酵母包括酿酒酵母、奇异酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母或毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PAM序列具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；所述随机序列K具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列或与其至少具有80％同源性的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9...

【技术特征摘要】

1.一种快速将二倍体宿主转变为单倍体宿主的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二倍体宿主为含有着丝粒的微生物或动物细胞；所述含有着丝粒的微生物包括酵母或原生动物；所述酵母包括酿酒酵母、奇异酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母或毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pam序列具有如seq id no:1所示的核酸序列；所述随机序列k具有如seq id no:2所示的核酸序列或与其至少具有80％同源性的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述基因编辑技术包括crispr/cas9技术。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a)具体包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ura3营养标签表达盒包括启动子和ura3基因，所述ura3基因的核酸序列如seq id no:3所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述染色体下同源臂和上游同源臂的长度为300～1000bp。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴毅，苏舒心，元英进，马渊，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：