【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物检测技术及疾病预后预测，具体地说，是结合血清多肽组和和临床指征在肝细胞肝癌tace预后评估的模型中的应用。
技术介绍
1、肝细胞癌占原发性肝癌85％～90％，肝癌是世界上最常见的癌症之一，也是癌症死亡的第四大原因(ca cancer j clin.2018；68:394-424)。由于肝癌早期临床症状不明显，明确诊断时70％～80％都已达到中晚期，根据临床实践指南，被诊断为中晚期肿瘤疾病的患者不适合进行根治性手术切除，但可进行局部介入治疗。目前，经皮肝动脉化疗栓塞术(tace)被公认为是肝癌最常用的局部治疗方法之一，不同于欧洲和日本，我国接受tace治疗的肝癌患者大部分有hbv感染和肝硬化背景，且分期相对较晚，肿瘤负荷较重，中位肿瘤的直径为6.5～6.7cm。根据巴塞罗那(barcelona clinic liver cancer,bclc)分期指南，建议tace也可以作为中期的治疗选择。但是，反复tace降低治疗效果，导致肝功能下降，减少生存时间。tace术后5年复发率70％-80％，总生存期(os)较低。而且不同临床特征的肝癌患者对tace治疗的反应不同，导致预后疗效不同，需要进行多次介入手术才能控制肿瘤的生长。
2、天然存在的肽，包括生长因子、激素和神经递质，是一类重要的生物分子，在人体生理学中起着至关重要的作用，是一种新兴的肿瘤生物标志物，广泛应用于各种肿瘤标志物的探索。多肽可以体现不同生理病理条件下蛋白的合成、加工和降解过程，对基因的表达、物质代谢等过程又有调节作用。
3、
技术实现思路
1、针对有效预测肝细胞肝癌进行tace治疗后临床疗效，预后标志物匮乏及预测灵敏度低、特异性低等一系列技术问题，本专利技术的目的是提供结合血清多肽组和和临床指征在肝细胞肝癌tace预后评估的模型中的应用，本专利技术采用非靶向多肽组学方法，从肝细胞肝癌患者tace治疗前和治疗后的血清中筛选出差异多肽，并与临床指征结合，用于肝细胞肝癌tace治疗后预后的预测。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种肝细胞肝癌tace预后评估的生物标志物，所述的生物标志物为血清多肽组，包括多肽avthgal(pep16863|q9ul54|130-136)和多肽hgstsgqssssgqhds(pep55851|q86yz3|844-859)。
4、本专利技术另一方面提供结合血清多肽组和临床指征在肝细胞肝癌tace预后评估的模型中的应用。
5、基于上述技术方案，进一步地，所述的血清多肽组包括多肽avthgal(pep16863|q9ul54|130-136)和多肽hgstsgqssssgqhds(pep55851|q86yz3|844-859)。
6、基于上述技术方案，进一步地，临床指征包括：随访过程中做手术的次数n，肝细胞肝癌tace预后评估指6个月和12个月疾病是否进展。
7、基于上述技术方案，进一步地，所述的血清多肽组通过以下过程筛选：
8、(1)筛选肝细胞肝癌患者，纳入标准：a.近3个月内进行tace治疗后处于sd期的hcc患者，再次拟行tace治疗；b.肝功能分级child-pugh a或b级；c.美国东部肿瘤协作组(easten cooperative oncology group,ecog)评分：0～2分；d.年龄范围：18岁～80岁；e.预计生存期>3个月；排除标准：a.门静脉主干完全闭塞，侧支循环减少，并且不能行门静脉血管成形术；b.合并动静脉瘘，且无法完全封堵；c.不能耐受手术者，并发症较多，多器官衰竭者；d.化疗药物和血管造影剂过敏者；e.合并肝性脑病原则；
9、(2)收集肝细胞肝癌患者tace术前1天和术后1天两份空腹晨血液样本，进行血清多肽组学分析前的预处理；
10、(3)采用nanohplc-ms/ms平台采集患者的血清多肽谱，通过数据库检索和统计分析获得多肽定性定量结果，并筛选出血清差异多肽；
11、(4)对步骤(3)筛选的血清差异多肽和临床指标，以疾病进展为结局事件，先使用cox单因素回归分析筛选，再用lasso回归消除变量间的多重共线性，使结果更加准确可信，再用cox多因素回归分析确定影响疾病进展的独立预后因素，最终筛选出血清多肽组。
12、基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中的血液样本在0～4℃，2000～20000g条件下离心去脂，获得澄清透亮，呈淡黄色，并且无溶血的血清。
13、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中血清多肽组学样品前处理步骤为：
14、1)低浓度乙腈处理：30μl去脂血清，经过稀释和煮沸变性后，加入含0.1％甲酸的40％乙腈can水溶液，涡旋，冰浴静置，离心去除杂质；
15、2)超滤：步骤1)的上清液加入到10kda超滤管，0～4℃，6000g条件下离心，收集离留液，向内衬管中加入含0.1％甲酸的20％乙腈can水溶液，0～4℃，6000g条件下离心，收集离留液；冻干后，使用1％ tfa水溶液复溶；
16、3)除盐：采用tip头或固相萃取小柱除盐，冻干；
17、4)供试品溶液制备：冻干样品用0.1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肝细胞肝癌TACE预后评估的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为血清多肽组，包括多肽AVTHGAL和多肽HGSTSGQSSSSGQHDS。
2.结合血清多肽组和临床指征在肝细胞肝癌TACE预后评估的模型中的应用，
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的血清多肽组通过以下过程筛选：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的血液样本在0～4℃，2000～20000g条件下离心去脂，获得澄清透亮，呈淡黄色，并且无溶血的血清。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中血清多肽组学样品前处理步骤为：
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中使用nanoHPLC-MS/MS平台为线性离子阱静电场轨道阱(LTQ orbitrap elite)，补集柱和分析柱为C18毛细管色谱柱；流动相为A相：0.1％甲酸水溶液，B相：含0.1％甲酸的80％乙腈水溶液；洗脱梯度为：0～10min，2％B；10～12min，2％～8％B；12～102min，8％～45％B；102～105
7.一种肝细胞肝癌TACE预后评估模型，其特征在于，所述的模型为：h(t,X)＝h0(t)exp(0.089*n+0.012*pep16863+0.146*pep55851)，其中，h(t,X)代表在时间t处与协变量(协变量：n、pep16863、pep55851)有关的风险函数；h0(t)代表基准风险函数，是与时间有关的任意函数，函数形式无任何限定；n：随访过程中做手术的次数。
8.权利要求7所述的模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：应用R语言对所述的血清差异多肽和临床指征进行回归分析，筛选显著指标，以疾病进展为结局事件，构建临床预后预测模型；回归分析方法包括：COX单因素、多因素回归分析和LASSO回归分析。
...【技术特征摘要】
1.一种肝细胞肝癌tace预后评估的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为血清多肽组，包括多肽avthgal和多肽hgstsgqssssgqhds。
2.结合血清多肽组和临床指征在肝细胞肝癌tace预后评估的模型中的应用，
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的血清多肽组通过以下过程筛选：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的血液样本在0～4℃，2000～20000g条件下离心去脂，获得澄清透亮，呈淡黄色，并且无溶血的血清。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中血清多肽组学样品前处理步骤为：
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中使用nanohplc-ms/ms平台为线性离子阱静电场轨道阱(ltq orbitrap elite)，补集柱和分析柱为c18毛细管色谱柱；流动相为a相：0.1％甲酸水溶液，b相：含0.1％甲酸的80％乙腈水溶液；洗脱梯度为：0～10min，2％b；10～12min，2％～8％b；12～102min，8％～45％b；102～105min，45％～95％b；105～114min，95％b；114～115min，95％～2％b；115...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋磊，梅丹，吴杰，张亮，王魁阳，隋成旭，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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