【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断，涉及试剂盒，具体涉及一种用于calr基因突变检测的引物组及试剂盒。
技术介绍
1、calreticulin(calr)是一种由417个氨基酸(mw：46kda)组成的物种间高度保守的伴侣蛋白，主要定位于内质网。calr包含三个不同的结构域：(1)n端凝集素样球状结构域(n-domain)，对发挥calr的伴侣功能至关重要，也负责calr与α整合素的相互作用；(2)中央富脯氨酸(p)结构域，具有高亲和力和低ca2+结合能力；(3)高酸性c端区域(c-domain)，具有低亲和力和高ca2+结合能力，末端kdel序列作为er滞留信号，确保calr能从高尔基体返回到内质网。calr参与新合成蛋白质和糖蛋白的质量控制系统，防止错误折叠的蛋白质过早从内质网输出，calr也参与其他生物稳态的关键过程，包括抗原呈递、ca2+稳态、细胞粘附、整合素信号和危险信号转导等。
2、2013年首次报道了骨髓增生性肿瘤(mpn)中的calr突变，迄今为止，鉴定到的50多种calr突变类型都是在calr的末端9号外显子的阅读框中少量删除或插入核苷酸引起的+1移码突变。最常见的两种calr突变是52bp缺失(l367fs*46)和5bp插入(k385fs*47)，分别为i型和ii型突变，这两种突变频率分别是53％和32％，e364gfs*49突变频率3％，其它calr突变类型的发生频率较低。突变calr都是+1移码突变，c端产生一个新的突变体特异性氨基酸序列，不同于野生型calr，突变calr蛋白的特异序列含有多个带正电荷
3、由于其疾病特异性和驱动突变的作用，calr突变被添加到who分类中原发性血小板血症(et)和原发性骨髓纤维化(pmf)主要标准的基因突变列表中。calr突变是mpn患者的积极预后因素，也是这些患者异源造血干细胞移植的有价值的预测生物标志物。mpn患者中calr基因获得性突变的存在，表明可以利用该突变作为微小残留病灶(mrd)的标志物。异体干细胞移植(asct)可以治愈大量骨髓纤维化患者，但10％到43％的移植患者发生复发导致治疗失败，复发最可能的原因是mrd的持续存在。有研究表明，在calr微小残留病灶时进行供体淋巴细胞输注的效果优于临床复发时，这说明calr mrd的早期检测很重要。除asct外，干扰素α、jak 1/2抑制剂等治疗方式也已经证实calr是有价值的分子标志物，可用于mrd的监测。calr突变的研究主要集中在常见的i型缺失和ii型插入突变，mrd监测的关键是检测mrd方法的高灵敏度，提高检测calr i型缺失和ii型插入突变的灵敏度显得尤为重要。
4、目前用于检测calr突变的分子生物学技术包括sanger测序、片段分析、高分辨率熔融曲线分析、实时荧光定量pcr以及高通量测序(ngs)。sanger测序是检测基因突变的金标准，但操作复杂，灵敏度低，只有10％-20％，无法准确定量及计算突变比例；荧光定量pcr灵敏度较高，可达1％，但依赖标准曲线，无法绝对定量，定量结果准确性易受抑制剂、试剂等因素的影响，可能出现假阳性和假阴性；ngs检测范围广，灵敏度可达1％，但成本高、操作复杂、流程长、结果需要专业的生信人员分析，此外，使用ngs技术检测短插入和缺失突变如calr突变时，很难区分突变和技术错误。总的来说，这些分子生物学技术灵敏度低且不能绝对定量，都表明这些技术仅适用于患者初诊，不适用于单基因动态mrd检测。为了提高监测calr mrd的灵敏度，开发了可超敏检测calr i型、ii型以及e364gfs*49型突变的微滴式数字pcr试剂盒。
5、微滴式数字pcr通过油包水处理将pcr反应体系分成数万个纳升级别的微滴，目的核酸片段随机均匀分散到微滴中，并在微滴中完成pcr反应，反应完成后，采集微滴荧光信号对阳性和阴性微滴进行计数，最终根据泊松分布原理计算反应体系中目标分子的拷贝数。数字pcr通过识别pcr反应完成的阴性和阳性微滴数来计算样本拷贝数，无需标准曲线即可对样品进行绝对定量，灵敏度高，可达0.01％；反应体系分配可减少抑制剂对pcr的影响，提高样品检测的准确性；而且数字pcr操作简便，结果分析直观易懂。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种操作简便、结果准确、灵敏度高、成本低廉和高通量的calr l367fs*46(i型)、k385nfs*47(ii型)以及e364gfs*49型突变检测的引物组与试剂盒，满足calr基因突变诊疗需求，本专利技术建立了一个基于数字微滴式数字pcr的检测calr突变的试剂盒，灵敏度高且重复性好，可用于mpn初诊患者calr突变的筛选和阳性患者mrd监测以指导治疗，为患者提供个性化管理途径。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术首先提供了一种用于检测calr基因突变的引物组，包括用于扩增calr基因的引物组合，检测突变型calr基因的探针与扩增ppih基因的引物；其中，扩增calr基因的引物序列包括如seq id no：1所示的calr f1引物、如seq id no：2所示的calr f2引物、如seqid no：3所示的calr f3引物以及seq id no：4所示的calr r1引物；所述检测突变型calr基因的探针的核苷酸序列如seq id no：5所示。
4、作为本专利技术的一种优选方案，还包括用于扩增内参ppih基因的引物组和检测ppih的探针；其中，用于扩增内参ppih基因的引物组包括如seq id no：6所示的ppih f引物与seq id no：7所示的ppih r引物；检测ppih的探针的核苷酸序列如seq id no：8所示。
5、作为本专利技术的一种优选方案，如seq id no：1所示的calr f1引物中，第15和第16位核苷酸为lna修饰；
6、如seq id no：2所示的calr f2引物中，第16和第17位核苷酸为lna修饰；
7、如seq id no：3所示的calr f3引物中，第15位核苷酸为lna修饰。
8、作为本专利技术的一种优选方案，检测突变型calr基因的探针序列的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；探针序列中第5、8、10以及14位核苷酸为lna修饰。
9、本专利技术还提供了一种用于检测calr基因突变的试剂盒，包括pcr反应液、数字pcr微流控芯片、微滴生成油、引物探针预混合液、阳性对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测CALR基因突变的引物组，其特征在于，包括用于扩增CALR基因的引物组合，检测突变型CALR基因的探针与扩增PPIH基因的引物；其中，扩增CALR基因的引物序列包括如SEQ ID NO：1所示的CALR F1引物、如SEQ ID NO：2所示的CALR F2引物、如SEQ IDNO：3所示的CALR F3引物以及SEQ ID NO：4所示的CALR R1引物；所述检测突变型CALR基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测CALR基因突变的引物组，其特征在于，还包括用于扩增内参PPIH基因的引物组和检测PPIH的探针；其中，用于扩增内参PPIH基因的引物组包括如SEQ ID NO：6所示的PPIH F引物与SEQ ID NO：7所示的PPIH R引物；检测PPIH的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测CALR基因突变的引物组，其特征在于，如SEQ IDNO：1所示的CALR F1引物中，第15和第16位核苷酸为LNA修饰；
4.根据权
5.一种用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、数字PCR微流控芯片、微滴生成油、引物探针预混合液、阳性对照以及阴性对照；所述引物探针预混合液包括权利要求1-4任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物探针预混合液包括CALR I型突变检测混合液、CALR II型突变检测混合液、CALR E364Gfs*49突变检测混合液与内参PPIH基因突变检测混合液。
7.根据权利要求6所述的用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述CALR I型突变检测混合液通过将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的母液与ddH2O的以体积比为18:18:5:9的比例混合得到；
8.根据权利要求5所述的用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，PCR扩增及荧光检测体系为：2*supermix 10μL，CALR突变型及内参PPIH基因引物探针预混合液各0.5μL，标本抽提模板DNA 5μL，用水补至20μL；PCR扩增条件为：95℃10min；40个循环(94℃30s，58℃60s)；98℃10min；4℃，hold。
9.根据权利要求5所述的用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为CALR突变基因的核苷酸序列合成的质粒与CALR突变阴性样本gDNA混合后的模板，CALR突变型质粒拷贝数大于500拷贝/μL，内参PPIH基因拷贝数大于1000拷贝/μL。
10.根据权利要求5所述的用于检测CALR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为：CALR突变阴性样本的gDNA，内参PPIH基因拷贝数大于1000拷贝/μL。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测calr基因突变的引物组，其特征在于，包括用于扩增calr基因的引物组合，检测突变型calr基因的探针与扩增ppih基因的引物；其中，扩增calr基因的引物序列包括如seq id no：1所示的calr f1引物、如seq id no：2所示的calr f2引物、如seq idno：3所示的calr f3引物以及seq id no：4所示的calr r1引物；所述检测突变型calr基因的探针的核苷酸序列如seq id no：5所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测calr基因突变的引物组，其特征在于，还包括用于扩增内参ppih基因的引物组和检测ppih的探针；其中，用于扩增内参ppih基因的引物组包括如seq id no：6所示的ppih f引物与seq id no：7所示的ppih r引物；检测ppih的探针的核苷酸序列如seq id no：8所示。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测calr基因突变的引物组，其特征在于，如seq idno：1所示的calr f1引物中，第15和第16位核苷酸为lna修饰；
4.根据权利要求1所述的一种用于检测calr基因突变的引物组，其特征在于，检测突变型calr基因的探针序列的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；探针序列中第5、8、10以及14位核苷酸为lna修饰。
5.一种用于检测calr基因突变的试剂盒，其特征在于，包括pcr反应液、数字pcr微流控芯片、微滴生成油、引物探针预混合液、阳性对照以及阴性对照；所述引物探针预混合...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖晨晨，董华，
申请(专利权)人：杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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