【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学超分辨显微成像领域，特别设计一种使用调制光斑用于照明和定位单分子荧光的显微成像方法和装置。
技术介绍
1、单分子定位显微镜(smlm)是一种通过定位稀疏闪烁荧光分子来打破衍射极限的技术。随机光学重构显微术、光活化定位显微术和dna-paint等是smlm方法的代表性技术。这些技术也对化学和细胞生物学的进步做出了重要贡献。在smlm中，分辨率和定位通量是极其重要的参数，它们极大地影响图像质量。根据smlm的原理，smlm的分辨率与检测到的光子总数密切相关。更高的光子计数可以更准确地拟合单分子荧光点扩散函数(psf)，从而提高亚像素位置的定位精度。因此，许多技术方案都致力于提高光子收集效率。可行的解决方案包括增加额外的荧光收集物镜，使用更亮的探针，使用氧清除系统。然而，即使使用了这些技术，通过smlm实现5纳米分子尺度的分辨率仍然具有挑战性。
2、近年来，采用结构光图案照明的方案，出现了minflux、minsted、simflux、rose等新的单分子定位技术。minflux以有限的总信号光子数实现了1纳米三维定位精度。它已在单分子追踪和超高分辨率成像中获得了多项研究成果。然而，minflux的点扫描系统限制了其成像视场(fov)，通常为几微米。受到minflux思想的启发，simflux和rose采用了宽场干涉条纹图案作为定位光束。这些技术提供了几十微米的fov，并且与传统smlm相比，实现了近两倍的横向分辨率增强。保持宽场smlm的定位分辨率和定位通量，干涉条纹照明图案也可以在轴向上扩展。mod-
3、其中，minflux、minsted，是基于单点检测器开发的超分辨显微术，定位精度高，但是定位通量比较低一次只能定位一个点，所以定位视野(fov)小；simflux、rose也是基于相机探测器的宽场定位方案，一次能定位很多点，定位通量高，但是simflux、rose使用的是条纹光定位，进一步开发的潜力不足。
4、传统的单分子定位荧光显微镜由于受到荧光光子数的限制，其分辨率一般会被限制在20nm左右，综合各种分辨率提升方法，如使用双物镜、氧去除系统、更亮的荧光探针等方案，其分辨率也很难达到5nm的尺度。使用结构光作为单分子显微镜的照明和定位光斑，已经被证明是一种切实可用的提升单分子定位精度的方案。晶格光是一种特殊的结构光斑，已经在晶格光片显微镜、晶格光结构光照明显微镜中得到应用。
5、利用特殊的照明图案来增强显微镜性能是显微镜工程的常见思路。晶格光指的是由特定方向的有限数目入射激光的相干叠加形成的结构化照明图案。在理想情况下，晶格光斑是一种非衍射的光束图案，借助其较高的图案对比度和穿透深度，能够增强显微镜性能。晶格光已经成功地在光片显微镜中作为照明光束使用，并获得了高分辨率、高速度和低光毒性的显微图像。原则上，在保留晶格光斑的优点的同时，晶格光斑也可以被用作smlm中的照明和定位光束，以实现高分辨率和定位通量。
6、相关文献：
7、1.gu,l.,li,y.,zhang,s.et al.molecular resolution imaging byrepetitive optical selective exposure.nat methods 16,1114–1118(2019).
8、2.cnossen,j.,hinsdale,t.,thorsen,et al.localization microscopy atdoubled precision with patterned illumination.nat methods 17,59–63(2020).
9、3.基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置，申请号202110928164.0。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，以实现高分辨率和高定位通量的单分子定位检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，包括：激发光光路模块，包括依次布置的：光源系统，设置为产生激光光束；晶格光产生系统，其设置为产生4束激发光束，并将激发光束转换为傅里叶空间频率级次光，所述激发光束用于在干涉时产生矩形阵列形式的晶格光的照明光斑；和晶格光斑传递系统，设置为将傅里叶空间频率级次光传递至物镜的后焦面，以在物镜的前焦面形成的晶格光的光斑，利用晶格光的照明光斑实现对样品的照明激发；以及荧光探测光路模块，其设置为提取出样品激发后的荧光信号，得到单分子定位图像。
3、所述晶格光产生系统还设置为精确快速调制晶格光的照明光斑的x方向和y方向的相位。
4、所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅、傅里叶变换透镜、分束器、高速空间光调制器，以及分束器下游的空间滤波器；
5、二维光栅设置为在接收激光光束后衍射产生两行两列的4束激发光束，4束激发光束用于在汇聚时干涉形成矩形阵列形式的晶格光的照明光斑；傅里叶变换透镜设置为将形成的晶格光进行光学傅里叶变换，以形成4束傅里叶空间频率级次光；所述分束器设置为使得来自傅里叶变换透镜的光透过以被高速空间光调制器接收且使得来自高速空间光调制器的光反射至第二光轴，从而分离经过高速空间光调制器调制和未经调制的光束；所述高速空间光调制器的靶面具有两行两列的4个靶面区域，其设置为通过4个靶面区域分别对4束傅里叶空间频率级次光进行随时间快速切换的相位调制；所述空间滤波器设置为对傅里叶空间频率级次光，通过空间滤波的方法滤出所述高速空间光调制器的靶面区域的第一对角线上的+1级次的2束傅里叶空间频率级次光，和所述高速空间光调制器的靶面区域的第二对角线上的-1级次的2束傅里叶空间频率级次光。
6、所述高速空间光调制器的靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3，且右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3的相位差时序来调制，从而组合共形成9组相位调制方式。
7、所述晶格光斑传递系统包括位于分束器的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜、第二传递透镜、第三传递透镜和反射镜，以及与反射镜一同位于第三光轴上的套筒透镜和物镜，所述傅里叶空间频率级次光成像于所述物镜的后焦面，且样品位于所述物镜的前焦面；第一传递透镜与第二传递透镜构成4f系统，用于将调制后的傅里叶空间频率级次光的像传递到第三传递透镜的前焦面；第三传递透镜和套筒透镜构成4f系统，用于将第二传递透镜传递的傅里叶空间频率级次光的像传递至物镜后焦面，物镜用于将4束傅里叶空间频率级次光聚焦在物镜的前焦面，以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光产生系统还设置为精确快速调制晶格光的照明光斑的X方向和Y方向的相位。
3.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅、傅里叶变换透镜、分束器、高速空间光调制器，以及分束器下游的空间滤波器；
4.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述高速空间光调制器的靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3，且右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3的相位差时序来调制，从而组合共形成9组相位调制方式。
5.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光斑传递系统包括位于分束器的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜、第二传递透镜、第三传递透镜和反射镜，以及
6.根据权利要求5所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述空间滤波器位于第二传递透镜和第三传递透镜之间。
7.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述荧光探测光路模块包括依次布置于第四光轴上的二向色镜、荧光滤片和相机；所述二向色镜设于套筒透镜和反射镜之间，其设置为将来自套筒透镜的荧光反射至荧光滤片。
8.根据权利要求7所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述荧光探测光路模块设置为在每次所述高速空间光调制器切换相位时，触发一次采集，以获得不同相位的单分子定位图像。
9.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，还包括数据处理模块，所述数据处理模块设置为对获得的不同相位的单分子定位图像进行处理，重建得到最终的超分辨图像。
10.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述数据处理模块设置为执行如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光产生系统还设置为精确快速调制晶格光的照明光斑的x方向和y方向的相位。
3.根据权利要求1所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光产生系统包括在第一光轴上依次布置的二维光栅、傅里叶变换透镜、分束器、高速空间光调制器，以及分束器下游的空间滤波器；
4.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述高速空间光调制器的靶面区域的傅里叶空间频率级次光的相位按照左上靶面区域减右下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3，且右上靶面区域减左下靶面区域的相位差依次为0，2π/3,4π/3的相位差时序来调制，从而组合共形成9组相位调制方式。
5.根据权利要求3所述的基于晶格光照明的单分子定位显微成像装置，其特征在于，所述晶格光斑传递系统包括位于分束器的下游且在第二光轴上依次排布的所述的第一传递透镜、第二传递透镜、第三传递透镜和反射镜，以及与反射镜一同位于第三...
【专利技术属性】
技术研发人员：高兆帅，曹晓捷，孙洁林，樊春海，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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