【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验，涉及一种小分子荧光免疫层析试纸条、检测卡及试剂盒。
技术介绍
1、小分子免疫检测法有：放射免疫法(radioimmunoassay,ria)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、化学发光免疫测定法(chemiluminescenceimmunoassay,clia)，主要通过竞争法进行待测物分析。
2、竞争法的主要缺点：1、其反应信号强度与样本中待测小分子的含量负相关，为间接检测模式，不能直接反映体系中的待测物的具体量；2、标记小分子与待测小分子与固相抗体结合的能力应该相当，不公平竞争可能产生的假阴性或假阳性结果；3、竞争法属于试剂有限型分析，固相抗体和标记抗原的量是固定的，且前者的结合位点少于标记抗原与待测抗原的总量，如果固相抗体或标记抗原量不适配将严重影响检测范围与灵敏度；4、竞争法易受到外界条件变化的干扰，试剂稳定性通常较差。
3、传统的夹心法，属于非竞争结合测定，没有竞争法的缺点，但是，其只适用于检测分子中具有至少两个以上的免疫结合位点的多价抗原，而不能用于小分子半抗原，例如25羟基维生素d(25-hydroxy vitamin d,25-(oh)d)的检测。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种小分子荧光免疫层析试纸条、检测卡及试剂盒，可以有效解决上述问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、一方面，本专利技术提供一种小分子荧光免疫层析试
4、所述标记抗体标记的荧光微球标记物能与所述小分子结合，形成免疫复合物，所述捕获抗体能特异性与所述免疫复合物结合。
5、在一些实施方式中，所述小分子为维生素d。
6、在一些实施方式中，所述小分子为25-(oh)d。
7、在一些实施方式中，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中的荧光微球为时间分辨荧光微球。
8、时间分辨荧光微球是针对免疫层析检测(lateral flow immunoassay)试剂设计，采用时间分辨荧光染料与苯乙烯共聚而成，具有stokes位移大、聚集时不会发生内淬灭效应、检测信号强、荧光染料包在微球里面，不易受外界环境影响、荧光稳定等特点。
9、时间分辨荧光免疫层析(trfilf)原理：当将含有待测抗原(抗体)的样品滴在加样区，待测样品中的抗原(抗体)与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体(抗原)结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体(抗原)结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。反应结束后，用紫外光源(340nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm)，且衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1-10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
10、在一些实施方式中，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中荧光微球与标记抗体的用量质量比例为1：0.030～0.135。
11、在一些实施方式中，所述25-(oh)d标记抗体标记的荧光微球标记物的制备方法，包括：
12、s11、取时间分辨荧光微球，加ph4.5～6.5的mes溶液离心洗涤，去除上清液，得到洗涤后的荧光微球，将洗涤后的荧光微球加ph4.5～6.5的mes溶液超声分散，制成微球混悬液i；
13、在一些实施方式中，将浓度为10mg/ml荧光微球混悬液于14000rpm的转速下离心10～20min，得到时间分辨荧光微球。
14、在一些实施方式中，步骤s11中，每次加mes溶液的体积均为荧光微球混悬液的两倍。
15、在一些实施方式中，加mes溶液于14000rpm的转速下离心10～20min洗涤。
16、s12、向所述微球混悬液i中加入edc和nhs混匀，在37℃摇床下震荡，反应结束后离心去除上清液，加ph7.0～8.0的hepes溶液超声分散，制成微球混悬液ⅱ；
17、在一些实施方式中，edc和nhs均用ph4.5～6.5的mes溶液溶解至10mg/ml。
18、在一些实施方式中，时间分辨荧光微球、edc、nhs的用量质量比例为1：0.01～0.2：0.01～0.2。
19、在一些实施方式中，在37℃摇床下震荡0.3～1h。
20、在一些实施方式中，时间分辨荧光微球与hepes溶液的用量比例为1mg：100μl。
21、s13、向所述微球混悬液ⅱ中加入25-(oh)d标记抗体混匀，在37℃摇床下震荡，反应结束后加入牛血清白蛋白，混匀，在37℃摇床下封闭，然后离心去除上清液，加清洗缓冲液离心洗涤，去除上清液，得到所述25-(oh)d标记抗体标记的荧光微球标记物；
22、在一些实施方式中，向所述微球混悬液ⅱ中加入25-(oh)d标记抗体混匀，补充ph7.0～8.0的hepes溶液，时间分辨荧光微球与补充后的液体的比例为1mg：200μl。
23、在一些实施方式中，在37℃摇床下震荡3.5h。反应结束后加入牛血清白蛋白，混匀，在37℃摇床上封闭30min，于14000rpm转速下离心10～20min去除上清液。
24、在一些实施方式中，时间分辨荧光微球与牛血清白蛋白的用量质量比例为1：0.5～2.0。
25、优选的，所述清洗缓冲液为质量分数为3％的吐温20溶液。
26、优选地，所述25-(oh)d标记抗体标记的荧光微球标记物加保存缓冲液贮存。进一步优选地，时间分辨荧光微球与所述保存缓冲液的用量比例为1mg：100μl。
27、在一些实施方式中，时间分辨荧光微球与所述25-(oh)d标记抗体的用量比例为1：0.030～0.135。在一些实施方式中，时间分辨荧光微球与所述25-(oh)d标记抗体的用量比例为1：0.030～0.10、1：0.10～0.135。在一些实施方式中，时间分辨荧光微球与所述25-(oh)d标记抗体的用量比例为1：0.030、1：0.10、1：0.135。
28、在一些实施方式中，所述玻璃纤维结合垫上吸附有标记抗体标记的荧光微球标记物的吸附方法为：将浓度为0.3～1.25mg/ml的所述标记抗体标记的荧光微球标记物在玻璃纤维结合垫上均匀喷涂一条线，用量为2～4μl/每厘米结合垫。
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1.一种小分子荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板、滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述滤血膜样品垫、所述玻璃纤维结合垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸收垫顺次搭接粘贴在底板上，所述玻璃纤维结合垫上吸附有标记抗体标记的荧光微球标记物，所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有捕获抗体；
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述小分子为维生素D。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中的荧光微球为时间分辨荧光微球。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中荧光微球与标记抗体的用量质量比例为1：0.030～0.135。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维结合垫上吸附有标记抗体标记的荧光微球标记物的吸附方法为：将浓度为0.3～1.25mg/mL的所述标记抗体标记的荧光微球标记物在玻璃纤维结合垫上均匀喷涂一条线，用量为2～4μL/每厘米结合垫。
6.根据权利
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述质控线为包被有兔抗DNP抗体的质控线；
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体标记的荧光微球标记物的制备方法，包括：
9.一种检测卡，其特征在于，所述检测卡包括如权利要求1-8中任一项所述的试纸条以及卡壳。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-8中任一项所述的试纸条或如权利要求9所述的检测卡。
...【技术特征摘要】
1.一种小分子荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板、滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述滤血膜样品垫、所述玻璃纤维结合垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸收垫顺次搭接粘贴在底板上，所述玻璃纤维结合垫上吸附有标记抗体标记的荧光微球标记物，所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有捕获抗体；
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述小分子为维生素d。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中的荧光微球为时间分辨荧光微球。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体标记的荧光微球标记物中荧光微球与标记抗体的用量质量比例为1：0.030～0.135。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维结合垫上吸附有标记抗体标记的荧光微球...
【专利技术属性】
技术研发人员：章观雄，杨家保，刘宁，
申请(专利权)人：厦门宝太生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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