【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医用材料领域，具体涉及一种用于car t细胞扩增和递送的生物支架及其制备方法。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t(car t)细胞疗法是过继细胞疗法中的一种，它通过从患者或其他供者中提取t细胞，在对其进行基因编辑，使其具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，最后将改造后的细胞(car t细胞)输注至患者体内发挥抗肿瘤作用。目前，car t细胞疗法在多种血液瘤如急性b淋巴细胞白血病(b-all)，非霍奇金淋巴瘤(nhl)及多发性骨髓瘤(mm)的治疗中取得了巨大成功，被认为是一种有望治愈肿瘤的新型免疫疗法。但相比之下，cart细胞疗法在实体肿瘤的临床治疗中还未显现显著效果。实体肿瘤致密的细胞外基质、复杂的脉管系统以及抑制性免疫微环境，限制了免疫细胞的有效浸润以及免疫细胞的增殖与活化，这也是该疗法在实体肿瘤治疗中屡屡失败的原因。
2、相比于静脉注射，使用瘤内注射car t可以更好的将细胞递送至肿瘤中。但由于肿瘤抑制性免疫微环境的存在，瘤内直接注射的car t细胞常常生存能力及活力较弱，不能持续发挥杀伤效果。为此，一些辅助car t细胞递送的器件如水凝胶、镍钛合金薄膜等被开发出来。但是这些元件多需要通过手术的方式植入肿瘤内，受肿瘤位置的限制，也可能造成肿瘤扩散。为此，一些给药更方便、能够实现car t细胞在肿瘤原位扩增并且存活的递送装置将有助于car t细胞疗法在实体肿瘤中的应用。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中递送car t细胞存在的给药不方便、受肿瘤位置限制
2、本专利技术第一方面提供了一种多孔微球生物支架的制备方法，其包括以下步骤：
3、(1)制备300-800微米的多孔微球，优选通过微流控技术制备例如500-600微米的多孔微球；
4、(2)将多氨基化合物修饰至所述多孔微球上；
5、(3)将刺激t细胞扩增的抗体或多肽通过链霉亲和素-生物素系统或点击化学嫁接于步骤(2)产生的多氨基化合物修饰的多孔微球。
6、在一些实施方案中，所述多氨基化合物例如为多聚赖氨酸或聚多巴胺，优选为多聚赖氨酸。
7、在一些实施方案中，步骤(1)中，所述多孔微球由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)制得。
8、在一些实施方案中，步骤(2)中，多聚赖氨酸为生物素化的多聚赖氨酸。
9、在一些实施方案中，步骤(3)中，所述刺激t细胞扩增的抗体或多肽包括至少一种第一信号和至少一种第二信号；所述第一信号为抗cd3抗体或peptide-mhc，所述第二信号为共刺激抗体，优选选自抗cd28抗体、抗cd137抗体和抗cd134抗体；例如所述第一信号为抗cd3抗体，和所述第二信号为抗cd28抗体。
10、在一些实施方案中，步骤(1)中，所述多孔微球制备步骤包括：
11、(i)将pva溶液作为连续相，例如将pva溶液连接到同轴针头的外针头作为连续相；将plga、挥发性溶剂、制孔剂和水的混合乳液作为分散相，例如将所述混合乳液连接到同轴针头的内针头作为分散相；
12、(ii)以25:1～5:1的流速比使连续相和分散相混合，在流体剪切的作用下产生微液滴；所述流速比例如为20:1；例如通过注射泵使连续相和分散相混合；
13、(iii)冰水浴搅拌过夜，使溶剂挥发；在温水浴中除去制孔剂，冷冻干燥获得多孔微球。
14、在一些实施方案中，步骤(i)中，所述pva溶液的终浓度为1～2％，例如1％；所述plga的终浓度为1.5％；所述制孔剂终浓度为1.9％；步骤(ii)中，用1～2％pva例如2％pva收集所述微液滴；步骤(iii)中，所述挥发性溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或三氯甲烷中的一种或多种，优选二氯甲烷。
15、在一些实施方案中，所述制孔剂为明胶、碳酸钠、碳酸氢钠、油酸钠、十八胺或甘油单油酸酯中的一种或多种，优选明胶。
16、在一些实施方案中，所述温水浴为45℃；优选在温水浴中搅拌3小时。
17、在一些优选的实施方案中，步骤(i)中，所述混合乳液的制备包括以下步骤：将7.5％明胶溶液和含2％plga的二氯甲烷溶液以1:3比例混合并均质，所述均质优选在15000rpm下进行3min。
18、在一些实施方案中，步骤(2)中，所述生物素化的多聚赖氨酸的制备包括以下步骤：(i)将d-生物素n-羟基琥珀酰亚胺酯及多聚赖氨酸溶于二甲亚砜中，并向反应体系中加入碱性溶剂使ph为8.3～8.5，例如反应24h；
19、较佳地，所述碱性溶剂为三乙胺或氢氧化钠，优选为三乙胺；
20、所述d-生物素n-羟基琥珀酰亚胺酯与所述多聚赖氨酸质量比为1:(1～2)，例如1:2；
21、(ii)反应结束后向反应体系中滴加无水乙醚至沉淀不再析出，离心弃去上层清液；
22、(iii)向沉淀中加入纯水使其溶解，透析后冷冻干燥，获得生物素化的多聚赖氨酸。
23、在一些实施方案中，步骤(3)中，所述嫁接包括以下步骤：
24、在步骤(2)产生的多聚赖氨酸修饰的多孔微球中加入含链霉亲和素的溶液，所述多聚赖氨酸与链霉亲和素质量比例如80:1～20:1，反应例如4-6h后，用清水洗涤；再加入生物素化的刺激t细胞扩增的抗体，所述多聚赖氨酸与所述刺激t细胞扩增的抗体浓度比为200:1～100:1，孵育例如12h后，获得刺激t细胞扩增的抗体功能化修饰的多孔微球。或，
25、在步骤(2)产生的多聚赖氨酸修饰的多孔微球中加入二本基环辛炔-琥珀酰亚胺酯，所述多聚赖氨酸与所述二本基环辛炔-琥珀酰亚胺酯质量比例如为2:5～3:5；刺激t细胞扩增的抗体加入叠氮丁酸nhs酯，所述刺激t细胞扩增的抗体与所述叠氮丁酸nhs酯的质量比为1:2～1:1，二者反应生成抗cd3抗体和抗cd28抗体修饰的多孔微球。
26、在一些实施方案中，所述制备方法还包括以下步骤：
27、(4)将获得的多孔微球生物支架与car t细胞共培养；优选所述多孔微球与所述car t细胞的数量比为1:(1×104～5×104)。
28、在一些优选的实施方案中，所述共培养进行2～38天，例如为6天或14天。
29、在一些优选的实施方案中，所述car t细胞的浓度为1×106～1×107/ml。
30、在一些优选的实施方案中，所述car t细胞中，编码所述car分子的核苷酸序列如seq id no:1所示。
31、本专利技术第二方面提供了本专利技术第一方面所述的制备方法获得的多孔微球生物支架。
32、本专利技术第三方面提供了本专利技术第二方面所述的制备方法获得的装载本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多孔微球生物支架的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制得；和/或，
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球制备步骤包括：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(i)中，所述PVA溶液的终浓度为1～2％；所述PLGA的终浓度为1.5％；所述制孔剂终浓度为1.9％；
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物素化的多聚赖氨酸的制备包括以下步骤：
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述嫁接包括以下步骤：
7.如权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：
8.如权利要求1～6任一项所述的制备方法获得的多孔微球生物支架。
9.如权利要求7所述的制备方法获得的装载了CAR T细胞的CAR T细胞-多孔微球递送系统。
10.如权利要求8所述的多孔
...【技术特征摘要】
1.一种多孔微球生物支架的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)制得；和/或，
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多孔微球制备步骤包括：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(i)中，所述pva溶液的终浓度为1～2％；所述plga的终浓度为1.5％；所述制孔剂终浓度为1.9％；
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物素化的多聚赖氨酸的...
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