【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及成像，具体涉及一种显微成像方法与应用。
技术介绍
1、荧光显微成像是指利用荧光分子标记样品中某些特定结构或成分，用波长较短的光激发这些荧光分子使其处于高能态，再对其退激过程中所发射的波长相对较长的荧光进行显微成像，又可称为荧光显微术。采用该技术，能通过标记生物样品中特定的结构或者分子，离子实现“功能成像”，从而获取样本信息。荧光显微成像过程中，光学设备采集的荧光信号的亮度决定了原始数据-图像的质量，进而影响样本信息的准确率。如：信号亮度过低时，样本产生的信号与噪声(背景信号)难以分辨；信号亮度过高时，邻近信号点的能量溢出(光学散射)造成伪阳信号。而荧光显微成像过程中，仪器受到多重因素影响，可能存在性能波动的情况，这也使得样品测试过程中产生的荧光信号不稳定，导致样本信息存在偏差。如：通过显微成像技术对核酸分子进行测序时，测序仪受芯片、激光器、试剂、光学系统等性能波动的影响，测序信号不稳定，导致测序结果存在偏差。
2、因此，亟需开发一种可以减少因为信号波动影响显微成像结果的呈现，进而影响对成像数据的判断的方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
2、为此，本专利技术第一方面提供一种显微成像方法，所述方法基于成像装置对固相载体表面的生物样本进行显微成像处理，其中，所述成像装置包括激光器，所述显微成像处理采用所述激光器基于第一光学参数对所述生物样本产生的荧光信号进行显微光学成像，且所述第一光学参数为亮度达标
3、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述第一光学参数的确定方法包括：
4、(i)基于初始光学参数，对所述生物样本进行第一反应，采集第一反应后所述固相载体表面的第一荧光信号，确定所述固相载体至少部分区域所述第一荧光信号的第一亮度；
5、(ii)对比所述第一亮度和预设标准亮度，判断所述第一亮度是否达标；
6、若是，则确定所述初始光学参数为第一光学参数；
7、若否，则基于预设函数调整所述初始光学参数，以确定所述预设函数中满足预设标准亮度时的第二光学参数；以所述第二光学参数代替所述初始光学参数重复步骤(i)和(ii)，直至亮度达标，确定所述第一光学参数，
8、其中，所述预设函数为对所述生物样本进行第二反应，采集第二反应后所述固相载体表面的第二荧光信号时，基于所述固相载体至少部分区域所述第二荧光信号的第二亮度与第三光学参数设立的函数，所述第二光学参数为第二激光功率和/或第二激光照射时间。
9、利用本专利技术的方法，可以减少显微成像过程中造成信号亮度波动的外在因素对显微成像获得的数据的准确性的影响，使得显微成像方法在应用过程中，不受限于仪器、设备、耗材、试剂、系统以及方法等带来的性能波动，均能获得稳定的荧光信号，从而提高显微成像数据的准确率。以通过显微成像技术对核酸分子进行测序的技术为例，该方法可以在测序仪存在芯片、激光器、试剂、光学系统等性能波动的情况下，获得稳定的测序信号，减少测序结果的偏差，从而提高测序的准确性。
10、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述初始光学参数的计算公式为：初始光学参数＝a×b，其中，a表示所述激光器的初始激光功率或初始激光照射时间基于所述初始激光功率和所述初始激光照射时间确定的初始激光参数，b表示所述固相载体的质控光学参数和平均光学参数的比值，所述质控光学参数为质控激光功率，所述平均光学参数为平均激光功率，或所述质控光学参数为质控激光照射时间，所述平均光学参数为平均照射时间，或所述质控光学参数为质控初始激光参数，所述平均光学参数为平均激光功率。
11、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述对所述生物样本进行第一碱基延伸反应，采集第一反应后的所述固相载体表面的第一荧光信号，确定所述固相载体至少部分区域的第一亮度的步骤，包括：对所述生物样本进行第一反应，采集所述固相载体表面发生第一反应的至少一个fov的图像，基于所述图像中各亮斑的亮度估算平均亮度，并将所述平均亮度输出为第一亮度。
12、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述图像为一个fov的图像。
13、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述第一反应为对所述生物样本进行前n次反应中的一次。
14、根据本专利技术的一些具体实施方案，n的取值范围为1～5。
15、根据本专利技术的一些具体实施方案，基于所述图像中各亮斑的亮度估算平均亮度的方法，包括：
16、基于一个fov中多个检测通道的图像，识别信号峰和背景峰；
17、基于所述信号峰和所述背景峰，分别拟合所述图像的全部像素的灰度值，确定信号峰分布曲线和背景峰分布曲线；
18、基于所述信号峰分布曲线和所述背景峰分布曲线，确定所述平均亮度。
19、根据本专利技术的一些具体实施方案，基于所述信号峰分布曲线和所述背景峰分布曲线，确定所述平均亮度，包括：
20、基于所述信号峰分布曲线，确定信号峰中位值；
21、基于所述背景峰分布曲线，确定背景峰中位值；
22、基于所述信号峰中位值和所述背景峰中位值，确定两者的差值，并以所述差值作为所述平均亮度。
23、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述预设标准亮度为预设标准亮度范围。
24、根据本专利技术的一些具体实施方案，对比所述第一亮度和预设标准亮度，判断所述第一亮度是否达标，包括：
25、对比所述第一亮度和所述预设标准亮度，若所述第一亮度在预设标准亮度范围内，则判定所述第一亮度达标；
26、若所述第一亮度不在预设标准亮度范围内，则判定所述第一亮度不达标。
27、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述预设函数包括选自亮度-激光功率函数、亮度-激光照射时间函数、亮度-激光功率-激光照射时间函数中的至少一种。
28、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述预设函数的建立方法为：
29、设置多个不同的第三光学参数，基于不同的第三光学参数进行反应，采集第三反应后所述固相载体表面的第三荧光信号，确定每一轮所述第三荧光信号的第二亮度，所述第三光学参数为预设激光功率、预设激光照射时间或预设的激光功率-激光照射时间数组；
30、基于所述第三光学参数以及所述第二亮度，拟合得到预设函数。
31、根据本专利技术的一些具体实施方案，所述基于预设函数调整所述初始光学参数，确定第二光学参数的步骤，包括：
32、基于所述预设函数和预设标准亮度，确定第四光学参数；
33、调整所述初始光学参数至第四光学参数，并将所述第四光学参数确定为第二光学参数。
34、根据本专利技术的一些具体实施方案，重复步骤(i)和(ii)的步骤中，每个步骤(i)中，所述第一亮度分别来源于同一次第一反应产生的图像中不同fov的第一亮度，或者
35、所述第一亮度分别来源于不同次第一反应的相同fov的第本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种显微成像方法，其特征在于，基于成像装置对固相载体表面的生物样本进行显微成像处理，其中，所述成像装置包括激光器，所述显微成像处理采用所述激光器基于第一光学参数对所述生物样本产生的荧光信号进行显微光学成像，且所述第一光学参数为亮度达标的激光功率和/或激光照射时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一光学参数的确定方法包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初始光学参数的计算公式为：初始光学参数＝A×b，其中，A表示所述激光器的初始激光功率或初始激光照射时间或基于所述初始激光功率和所述初始激光照射时间确定的初始激光参数，b表示所述固相载体的质控光学参数和平均光学参数的比值，
4.一种显微成像装置，其特征在于，包括激光器，以及第一光学参数确定系统，所述第一光学参数确定系统用于确定固相载体表面的生物样本进行显微成像处理时的第一光学参数，且所述第一光学参数为亮度达标的激光功率和/或激光时间。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第一光学参数确定系统包括：
6.根据权利要求5所述的装置，
7.权利要求4-6中任一项所述的显微成像装置在测序中的用途。
8.一种测序芯片的预设光学参数获取方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的显微成像方法中的第一光学参数的确定方法得到第一光学参数，将所述第一光学参数值作为所述测序芯片的预设光学参数。
9.一种测序方法，其特征在于，所述测序方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的显微成像的方法对测序芯片上的生物样本产生的荧光信号进行显微光学成像，或者利用权利要求4-6中任一项所述的显微成像装置对测序芯片上的生物样本产生的荧光信号进行显微光学成像，通过分析成像结果，以便获得测序芯片上的生物样本的具体序列。
10.一种确定测序过程中光学参数的电子设备，其特征在于，包括存储器、处理器；
11.一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机程序，其特征在于，所述程序被处理器执行时实现权利要求1-3中任一项所述的显微成像方法。
...【技术特征摘要】
1.一种显微成像方法，其特征在于，基于成像装置对固相载体表面的生物样本进行显微成像处理，其中，所述成像装置包括激光器，所述显微成像处理采用所述激光器基于第一光学参数对所述生物样本产生的荧光信号进行显微光学成像，且所述第一光学参数为亮度达标的激光功率和/或激光照射时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一光学参数的确定方法包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初始光学参数的计算公式为：初始光学参数＝a×b，其中，a表示所述激光器的初始激光功率或初始激光照射时间或基于所述初始激光功率和所述初始激光照射时间确定的初始激光参数，b表示所述固相载体的质控光学参数和平均光学参数的比值，
4.一种显微成像装置，其特征在于，包括激光器，以及第一光学参数确定系统，所述第一光学参数确定系统用于确定固相载体表面的生物样本进行显微成像处理时的第一光学参数，且所述第一光学参数为亮度达标的激光功率和/或激光时间。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第一光学参数确定系统包括：
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述初始光学参数的计算公式为：初始光学参数...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雷，陈巍月，蔡金森，尚欢，全威，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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