【技术实现步骤摘要】
本申请涉及筛选和评估物质组合物的方法。
技术介绍
1、菊花(flos chrysanthemum)是菊花(chrysanthemum morifolium ramat)的头状花序(flower head)，是中国最受欢迎的花茶成分之一，用于预防炎症和肝脏保护。此外，菊花用于食品和饮料中，并作为传统中药对于清热，清除毒素，治疗脂肪肝和改善视力起着重要作用。药理学研究揭示了菊花的抗氧化、抗炎和抗过敏特性。此外，植物化学研究表明，菊花的主要成分是二咖啡酰奎宁酸，如1,3-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸，以及类黄酮，如芹菜素，木犀草素和木犀草苷。
2、透明质酸(ha)是一种高分子量的线性酸性糖胺聚糖，被认为参与许多生理过程，如炎症，细胞迁移和肿瘤发展。ha的重复二糖结构具有病原体相关分子模式的特征。小的ha碎片增加细胞因子il-1β、tnf-α和il-12的巨噬细胞产生，并增加巨噬细胞的同种异体刺激(allostimulatory)能力。在人类中，ha的降解主要是由透明质酸酶(“ha酶”)的活化引起的。ha的酶降解产生广泛的生物活性寡糖，其促炎性，血管生成性和免疫刺激性可归因于这些寡糖。已知ha酶使ha的减少和外源性炎症介质浸润到体内会引起炎症反应。在炎症期间，ha酶的量急剧增加，进一步诱导炎症的发生和发展。有效的ha酶抑制剂可以阻止ha碎片化，从而具有抗炎活性。因此，ha酶活性的调节可能会降低组织炎症的风险，并可能导致新的抗炎药的开发。
3、植物提取物已被证明可以抑制人ha酶。例如，车前草(planta
4、已知的ha酶抑制方法因使用强酸和强碱而变得复杂，这极大地影响了类黄酮化合物的紫外线吸收，产生大的偏差。此外，鉴定ha酶抑制剂的传统方法包括许多耗时、复杂且不稳定的步骤。
5、液相色谱-质谱(“lc-ms”)是功能强大的分析物检测和测量技术，是检测小分子分析物以用于诊断目的的首选方法之一。然而，lc-ms所需的仪器在技术上很复杂，因此通常不适合普通的医院临床实验室或医学实验室技术人员，因为普通的医院临床实验室没有采用lc-ms诊断，而是通常使用替代诊断技术，包括自动免疫测定，或将样本发送到参考实验室进行分析。如果程序得到简化和基本自动化，即使参考实验室或其他类型的测试实验室，包括但不限于用于测试工业或环境样品的实验室，也将更广泛地使用lc-ms。
6、目前的lc-ms方法需要为每种不同的目标分析物仔细选择合适的液相色谱柱和流动相，并仔细校准质谱仪以分离和鉴定目标分析物。为了在同一仪器上分析第二种不同的分析物，一个或多个色谱柱，流动相或质谱仪设置通常必须由lc-ms技术人员进行更改和优化。由于这种变化的时间和技术复杂性，单个样品的随机存取分析成本高昂且低效。相反，标记为分析相同或类似分析物的样品通常被分组为大批次并一起运行。虽然这种安排可以减少从运行到运行(from run-to-run)的lc-ms系统设置的更改次数，但每个样品的结果时间显著增加。lc-ms设置和处理的高度复杂性要求有专业的lc-ms技术人员在场随时进行调整，手动更改和对系统进行硬件重新配置。
7、由于医院通常没有配备或雇用人员来执行复杂的分析化学实验，因此lc-ms系统在今天的医院通常不可用。相反，标记为lc-ms分析的样品被发送到少数中央参考实验室，在那里根据有序的测定类型对样品进行分批。这种做法既耗时又昂贵。这种情况使得很难对同一样品进行多次分析。在分析其批次之前，样品可能会保留数小时甚至数天，并且每次要测定不同的分析物时，可能必须将含有多种目标分析物的样品单独等分或放回队列批次中。如果医院不在具有lc-ms设备的主要参考实验室附近，则必须将样本运送到实验室和从实验室运输，从而造成进一步的延迟。对于时间敏感的分析(例如，对于急诊科患者或含有不稳定分析物的样品)，这种延迟是不可接受的。对于更常规的测试，这种延迟和增加的费用使得许多功能强大的lc-ms诊断测试今天对于许多医院和诊断实验室来说都是不可用的。
8、通过减少纯化和分析具有不同特性的各种不同的化合物所需的不同色谱柱和流动相缓冲液的数量，lc-ms分析已经被努力简化。
9、与质谱耦合的超滤亲和液相色谱(“uf-lc-ms”)是一种配体捕捞技术，其中ms可以比单独通过ha酶抑制更容易识别从酶中释放的目标分子。uf-lc-ms可用于从复杂的混合物(例如草药提取物)或组合文库中筛选潜在的生物活性酶抑制剂(例如，α-糖苷酶，黄嘌呤氧化酶，神经氨酸酶和酪氨酸酶)，而无需重复和复杂的分离和纯化过程。目前的uf-lc-ms技术由于非特异性配体结合而产生假阳性结果。
10、从复杂混合物中筛选和鉴定化合物的更快和更有效的方法将代表对本领域的有用贡献。
技术实现思路
1、在一个实例中，本公开提供了鉴定混合物中化合物的方法，其包括：用酶的溶液孵育所述混合物的溶液，以便在所述酶和所述化合物之间形成酶-化合物复合物；通过超滤单元过滤所述混合物的溶液和所述酶的溶液，以提供滤液；通过液相色谱-质谱分析所述滤液以提供色谱图；以及将所述色谱图与第二滤液的第二色谱图进行比较，以鉴定化合物。所述混合物可包括草本提取物。所述混合物可包括来自菊花(chrysanthemum morifolium)的提取物。所述混合物可包括组合文库。所述酶可以选自透明质酸酶、α-葡萄糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、神经氨酸酶和酪氨酸酶。所述酶可以是透明质酸酶。所述酶的溶液可以包括ph为5.6的乙酸盐缓冲液中的透明质酸酶。所述酶的溶液可具有10mg/ml的酶浓度。孵育温度可为约37.5℃。孵育时间可能持续约30分钟。所述第二滤液可以通过过滤所述混合物的第二溶液来获得，所述混合物的第二溶液不与酶一起孵育。所述化合物可选自圣草酚-7-o-葡糖苷、木犀草苷、木犀草素-7-o-葡糖苷酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素7-o-葡糖苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸和香叶木素7-o-β-d-葡糖苷(diosmetin 7-o-β-d-lucoside)。所述化合物可选自圣草酚-7-o-葡糖苷、木犀草苷、芹菜素7-o-葡糖苷和香叶木素7-o-β-d-葡糖苷。所述第二滤液可以通过过滤所述混合物的第三溶液和酶的第二溶液来获得，其中所述酶的第二溶液在孵育之前与所述酶的竞争性抑制剂的溶液预孵育。所述竞争性抑制剂可以是甘草酸二钾。所述化合物可抑制no自由基、tnf-α和/或il-6。所述化合物可抑制inos、il-1β和/或myd88的mrna表达。
2、进一步适用性领域将从本文提供的描述中变得显而易见。应当理解，描述和具体实例仅用于说本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.鉴定混合物中化合物的方法，其包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含草本提取物。
3.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含来自菊花的提取物。
4.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包括组合文库。
5.权利要求1所述的方法，其中所述酶选自透明质酸酶、α-葡萄糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、神经氨酸酶和酪氨酸酶。
6.权利要求1所述的方法，其中所述酶是透明质酸酶。
7.权利要求1所述的方法，其中所述酶的溶液包括在pH为5.6的乙酸盐缓冲液中的透明质酸酶。
8.权利要求1所述的方法，其中所述酶的溶液具有10mg/mL的酶浓度。
9.权利要求1所述的方法，其中孵育温度为约37.5℃。
10.权利要求1所述的方法，其中孵育时间持续约30分钟。
11.权利要求1所述的方法，所述第二滤液通过过滤所述混合物的第二溶液来获得，所述混合物的第二溶液不与酶一起孵育。
12.权利要求11所述的方法，其中所述化合物选自圣草酚-7-O-葡糖苷、木犀草苷、木犀草素-7
13.权利要求11所述的方法，其中所述化合物选自圣草酚-7-O-葡糖苷、木犀草苷、芹菜素7-O-葡糖苷和香叶木素7-O-β-D-葡糖苷。
14.权利要求1所述的方法，其中所述第二滤液通过过滤所述混合物的第三溶液和所述酶的第二溶液来获得，
15.权利要求14所述的方法，其中所述竞争性抑制剂是甘草酸二钾。
16.权利要求14所述的方法，其中所述化合物选自圣草酚-7-O-葡糖苷、木犀草苷、芹菜素7-O-葡糖苷和香叶木素7-O-β-D-葡糖苷。
17.权利要求1所述的方法，其中所述化合物抑制NO自由基、TNF-α和/或IL-6。
18.权利要求1所述的方法，其中所述化合物抑制iNOS、IL-1β和/或MyD88的mRNA表达。
...【技术特征摘要】
1.鉴定混合物中化合物的方法，其包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含草本提取物。
3.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含来自菊花的提取物。
4.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包括组合文库。
5.权利要求1所述的方法，其中所述酶选自透明质酸酶、α-葡萄糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、神经氨酸酶和酪氨酸酶。
6.权利要求1所述的方法，其中所述酶是透明质酸酶。
7.权利要求1所述的方法，其中所述酶的溶液包括在ph为5.6的乙酸盐缓冲液中的透明质酸酶。
8.权利要求1所述的方法，其中所述酶的溶液具有10mg/ml的酶浓度。
9.权利要求1所述的方法，其中孵育温度为约37.5℃。
10.权利要求1所述的方法，其中孵育时间持续约30分钟。
11.权利要求1所述的方法，所述第二滤液通过过滤所述混合物的第二溶液来获得，所述混合物的第二溶液不与酶一起孵育。
12.权利要求11所述的方法，...
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