【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生命科学中的生物，具体是一种利用aerolysin纳米孔道在单分子水平上检测糖链的方法。
技术介绍
1、糖链作为自然界已发现的最为复杂的生物聚合物，在众多生命活动中都起着重要的作用，与糖链所扮演的丰富角色相对应的是其结构的复杂多样性。糖链的结构多样性主要源于：(1)丰富的单糖构筑基元(文献统计自然界已发现高达120种单糖)，且结构差异小，很多都是同分异构体；(2) 多样化的糖苷键，单糖上多个羟基都可以与另一个单糖形成糖苷键连接，因此产生了多种多样的位置异构体；(3)糖链可以是线性的，也可以是双分支、三分支或四分支结构，且亦存在多种异构体。这种复杂性导致糖链的结构解析极为困难。除了复杂性之外，与核酸和蛋白质具有本质上不同的是，糖链是一种非模板驱动合成的生物聚合物，无法实现扩增放大，并且最具最具研究价值的寡糖链(例如糖蛋白上的n-链接和o-链接糖链等) 种类繁多，丰度极低，这一切都造成了糖链的来源极为有限，进一步增加了糖链结构解析的难度。因此，糖链结构解析和测序是一个公认的世界级难题，制约着科学家探索神秘的糖生物学世界。
2、纳米孔单分子检测技术具有简单、快速、高灵敏且低成本等优点，为单分子级别的分子生物学研究打开了新的大门。该技术是在外部电压的驱动下，使得尺寸略小于孔径的分子通过纳米孔，监测分子穿过时产生的电流变化，对分子的特征进行分析。纳米孔单分子检测技术已经成功应用于 dna的单分子测序，并且正为测序蛋白进行探索。理论上，基于纳米孔的单分子传感技术提供了一种理想的糖链结构解析甚至测序的工具。但目前的进
技术实现思路
1、本专利技术旨在解决上述挑战，提供一种基于aerolysin纳米孔道的用于检测不同糖链的方法，该方法能够实现超灵敏的糖链单分子检测，朝未来糖链的单分子测序的发展迈出了关键的一步。为实现这一目的，本专利技术采取了以下技术方案：
2、一种基于aerolysin纳米孔道的糖链单分子方法，其主要步骤为：
3、(1)对糖链进行标记。选择连接有伯胺基、肼基或羟胺基的芳环类化合物与糖链的还原端半缩醛进行反应，反应方法为还原胺化。针对酸性的唾液酸糖链，直接采用含有伯胺基、肼基或羟胺基的芳环类化合物(缩写为ar基团)作为标签。标记反应如下式所示：
4、
5、ar基团可以是以下基团中的一种：
6、
7、其中r1可以为单糖基或寡糖基，与末端还原性单糖(即式中所示)构成完整寡糖链；
8、r2取代基可以是氢、烷烃基(c1～c5)、甲氧基、硝基或氰基。
9、(2)对中性糖链，采用唾液酸糖链作为“火车头”先与含双伯胺基、双肼或双羟胺类芳环基团化合物反应，生成的衍生物含有一个剩余的伯胺基、肼基或羟胺基，作为复合标签继续与中性糖链还原端的半缩醛羟基进行还原胺化反应，实现标记。标记反应如下所示：
10、
11、其中r1可以为单糖基或寡糖基，与末端还原性单糖(即式中所示)构成完整寡糖链。
12、(3)组装磷脂双分子层，嵌入aerolysin蛋白形成单个纳米孔道。以正癸烷为溶剂配制磷脂(二植酰磷脂酰胆碱)溶液(30mg/ml)，采用酚醛树脂检测池(由一个树脂杯插入树脂槽中构成，其中杯容积1.5ml,槽剩余体积1.5ml)(美国warner公司)，树脂杯为cis池，剩余树脂槽空间为trans池，树脂杯壁(1mm厚)有一个150μm的小孔，在孔周围直径5mm区域用00号貂毛画笔涂覆磷脂溶液(约2ul)，晾干；向两池中各加入1ml 10mm tris-hcl (含1mkcl,1mm edta,ph 8.0)电解液(液面确保高小孔)，通过提拉法在小孔上形成磷脂双层膜。再加入aerolysin蛋白溶液，等待孔道的组装嵌入。于两池中插入ag/agcl电极，trans池电极连接仪器headstage正极，cis池电极接headstage负极(接地)。
13、(4)将标记过的糖链溶于电解液中，取1μl糖链溶液注入cis池电解液中，电解液中糖链的最终浓度为1μm～20μm。仪器施加电压+70～+150mv，采样率100～250khz，低通滤波5～10khz。开始糖链的阻断电流信号采集。
14、(5)对糖链信号进行分析。记录到的阻断电流脉冲信号，可以提取到电流脉冲大小，脉冲时间，以及脉冲的频率，根据电流大小和时间做出事件的散点指纹图，基于此实现对不同糖链的辨识。
15、步骤(1)所述糖链，包含末端为还原型糖的2～20个单糖构成的中性糖链和酸性糖连，其中单糖可以是唾液酸、半乳糖、葡萄糖、n-乙酰半乳糖、 n-乙酰葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸。其中酸性糖链和中性糖链可以是直链型和双分支型糖链(分支长度可以是2～10 个单糖)。
16、步骤(1)所述的苯环类标签，可以是含有伯胺基、肼基或羟胺基的芳环类化合物，其中芳环基团为苯、二苯基醚、联苯、萘、蒽、芘、或四苯乙烯及不同中性取代物。
17、本专利技术能在单分子水平上对不同异构的或不同长度的糖链进行检测和辨识，该方法操作简单，样品用量少，灵敏度高，对糖链精细结构解析和测序具有非常重要的意义；同时该方法操作简单，成本低，有望为糖组学提供一种单分子检测分析工具。
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1.一种基于Aerolysin纳米孔道的糖链单分子检测方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：所述含芳环基团的标签是指带有伯胺基、肼基或者羟胺中的一种或二种以上的芳环基团，步骤(1)所述糖链的标记方法为还原胺化反应，即利用芳环基团连接的伯胺基、肼基或者羟胺中的一种与糖链还原端的半缩醛羟基反应，再经过氰基硼氢化钠还原；
4.根据权利要求1或2或3所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：所述步骤(2)所用磷脂为二植酰磷脂酰胆碱，所用蛋白孔道由Aerolysin(气单胞菌溶素)组装而成。
7.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中测试装置trans池电解液中Ag/AgCl电极连接Axon 200B仪器Headstage探头，cis池电解液中Ag/AgCl电极连接接地端；标记的糖链分
8.根据权利要求1所述一种基于Aerolysin纳米孔道的糖链单分子检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中糖链单分子信号，包括阻断电流和阻断时间，其中不同糖链对应于不同的阻断电流大小和不同阻断时间。
...【技术特征摘要】
1.一种基于aerolysin纳米孔道的糖链单分子检测方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：所述含芳环基团的标签是指带有伯胺基、肼基或者羟胺中的一种或二种以上的芳环基团，步骤(1)所述糖链的标记方法为还原胺化反应，即利用芳环基团连接的伯胺基、肼基或者羟胺中的一种与糖链还原端的半缩醛羟基反应，再经过氰基硼氢化钠还原；
4.根据权利要求1或2或3所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的糖链单分子检测方法，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：卿光焱，李闵闵，熊雨婷，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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