【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物模型构建，具体涉及一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法。
技术介绍
1、肝脏是人体“核心的”代谢器官，与高血压、高血脂、糖尿病等代谢性疾病密切相关。肝细胞在肝脏参与的各种代谢过程中发挥了主要作用，小鼠原代肝细胞在生命科学
应用广泛。
2、胰岛素抵抗(ir)是指胰岛素的外周组织及其靶器官或靶组织对胰岛素的敏感性及反应性降低，导致正常量的胰岛素产生的生物学效应低于正常水平。此时，机体为了保持内环境的稳定和血糖正常，代偿性地增加胰岛素分泌，临床可表现为高胰岛素血症。目前医学界普遍把中心性肥胖(内脏性肥胖)、高血压、血脂紊乱及血管内皮损伤等一系列构成心血管疾病的高危因素，统称为“代谢综合征”。现代研究表明，胰岛素抵抗是引起“代谢综合征”的基础，并且把伴有胰岛素抵抗的糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、脑卒中称为“死亡五重奏”。因此，对胰岛素抵抗的预防及治疗的研究具有重要的意义，而建立理想的胰岛素抵抗模型则对研究该类疾病的发生机制，评估药物疗效、治疗策略的有效性和安全性起到关键作用。
技术实现思路
1、要解决的技术问题：针对胰岛素抵抗的预防及治疗问题，本专利技术的目的是提供一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法。本专利技术采用两步灌流法提取原代肝细胞，操作简便，活细胞获得率高，细胞活力好，并在提取的小鼠原代肝细胞的基础上建立胰岛素抵抗模型。
2、技术方案：一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，包括以下步骤：s1.原
3、s2.细胞计数和培养：将重悬细胞铺板在鼠尾胶原包被的六孔板上培养，细胞贴壁后，4h后换新的原代肝细胞完全培养基，此后每24h换一次完全培养基，培养至48h；
4、s3.造模：将完全培养基更换为不含fbs的培养基培养，饥饿处理2～3h后再次换液为含0.5mm油酸-棕榈酸的5％bsadmem高糖溶液对细胞处理24～48h；将细胞培养液更换为含100nm胰岛素的5％bsadmem高糖溶液，处理12～24h，得到胰岛素抵抗模型。
5、进一步的，所述步骤s1中灌流液i组成为0.5mm egta、10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100单位/50的肝素钠，用不含钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50ml，过滤即得；所述灌流液ii组成为10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100u/ml iv型胶原酶，用含有钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50ml，过滤即得。
6、进一步的，所述步骤s1中洗涤缓冲液组成为pbs+2％fbs溶液。
7、进一步的，所述步骤s1中细胞悬液首次离心条件为4℃，100g离心2～3min；所述40％percoll的添加量与重悬后的细胞悬液的体积比为1:0.5～1:1.5；所述再次离心条件为4℃，400g离心5～10min；所述最后离心条件为50g离心1～2min。
8、进一步的，所述步骤s1中40％percoll为100％percoll:1*pbs＝4:6。
9、进一步的，所述100％percoll为percoll细胞分散液:10*pbs＝9:1。
10、进一步的，所述步骤s1中原代肝细胞完全培养基组成为dmem+10％fbs+1％双抗+1nm胰岛素+100nm地塞米松。
11、进一步的，所述步骤s2中鼠尾胶原包被的六孔板制备方法为：将3～5mg/ml的鼠尾胶原母液用0.3～0.4g/l的无菌乙酸稀释，向6孔板中加入稀释后浓度为0.02～0.03mg/ml的鼠尾胶原液，每孔添加量为1550～1600ul，室温放置，用pbs缓冲液冲洗3～4次，或在无菌操作台上隔夜晾干。
12、进一步的，所述步骤s2中重悬细胞铺板的密度为5～6×105个/孔；培养条件为37℃，5％co2。进一步的，所述步骤s3中油酸-棕榈酸的体积比为2:1。
13、有益效果：
14、1.本专利技术使用小鼠原代肝细胞具有以下优点：1)原代肝细胞由于离体时间短，能够保持体内的生物学特性，是更接近体内环境的研究模型；2)原代肝细胞能够避免体内实验时肝脏其他细胞对肝细胞的影响，从而得出更加准确的研究结果；3)原代肝细胞相比体内实验具有更好的可控性。本专利技术采用两步灌流法提取小鼠原代肝细胞，操作简便，活细胞获得率高，细胞活力好，为后续胰岛素抵抗模型的建立提供了良好的基础。
15、2.本专利技术在提取小鼠原代肝细胞的基础上构建了胰岛素抵抗模型，通过对细胞活性和葡萄糖吸收情况进行检测，发现细胞活性无显著下降且葡萄糖吸收量显著降低，细胞糖原含量显著降低，说明胰岛素抵抗模型构建成功。该模型的成功构建对胰岛素抵抗的预防及治疗的研究具有重要的意义，对研究该类疾病的发生机制，评估药物疗效、治疗策略的有效性和安全性起到关键作用。
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1.一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中灌流液I组成为0.5mM EGTA、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100单位/50的肝素钠，用不含钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50mL，过滤即得；所述灌流液II组成为10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100U/mL IV型胶原酶，用含有钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50mL，过滤即得。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中洗涤缓冲液组成为PBS+2％FBS溶液。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中细胞悬液首次离心条件为4℃，100g离心2～3min；所述40％percoll的添加量与重悬后的细胞悬液的体积比为1:0.5～1:1.5；所述再次离心条件为4℃，400g离心5～10min；所述最后离心条件为50g离心1～2min。
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6.根据权利要求5所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于，所述100％percoll为percoll细胞分散液:10*PBS＝9:1。
7.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中原代肝细胞完全培养基组成为DMEM+10％FBS+1％双抗+1nM胰岛素+100nM地塞米松。
8.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S2中鼠尾胶原包被的六孔板制备方法为：将3～5mg/mL的鼠尾胶原母液用0.3～0.4g/L的无菌乙酸稀释，向6孔板中加入稀释后浓度为0.02～0.03mg/mL的鼠尾胶原液，每孔添加量为1550～1600uL，室温放置，用PBS缓冲液冲洗3～4次，或在无菌操作台上隔夜晾干。
9.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S2中重悬细胞铺板的密度为5～6×105个/孔；培养条件为37℃，5％CO2。
10.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S3中油酸-棕榈酸的体积比为2:1。
...【技术特征摘要】
1.一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中灌流液i组成为0.5mm egta、10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100单位/50的肝素钠，用不含钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50ml，过滤即得；所述灌流液ii组成为10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100u/ml iv型胶原酶，用含有钙镁的汉克斯平衡盐溶液补充至50ml，过滤即得。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中洗涤缓冲液组成为pbs+2％fbs溶液。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于：所述步骤s1中细胞悬液首次离心条件为4℃，100g离心2～3min；所述40％percoll的添加量与重悬后的细胞悬液的体积比为1:0.5～1:1.5；所述再次离心条件为4℃，400g离心5～10min；所述最后离心条件为50g离心1～2min。
5.根据权利要求1所述的一种小鼠原代肝细胞提取及胰岛素抵抗模型的建立方法，其特征在于，所述步骤s1中40％percoll为100％perc...
【专利技术属性】
技术研发人员：马玲君，李伟，季俊夫，孙瑞璐，陈芳，胡小松，牟瑶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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