【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种功能增强型nk细胞的制备方法与应用。
技术介绍
1、nk细胞，也称自然杀伤细胞(natural killer cell)，来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，能够产生促炎细胞因子、杀死被病毒感染的细胞或癌细胞。nk细胞具有细胞毒性活性，功能与cd8t细胞相似。与b细胞和t细胞不同，nk细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，表面标志的特异性是相对的，是表达激活受体和抑制受体的随机组合。通过不同受体表达的刺激信号与抑制信号的平衡使nk细胞表现出对靶细胞的应答或耐受。随着时间的推移、医学研究的深入、医疗技术的发展，有关nk细胞的抗癌研究呈指数增长，成为免疫疗法创新的主要领域，nk细胞介导的免疫疗法已成为一种安全有效的疗法。然而，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤微环境(tme)使nk细胞的抗肿瘤功效被显著抑制。此外，因为tme存在使nk浸润不足和抑制性受体表达增加而活化性受体表达下降等问题，临床前和临床数据表明nk细胞治疗实体瘤的疗效比各种血液肿瘤效果差。迫切需要寻求新的提高nk细胞效应功能包括基因修饰的nk细胞的抗肿瘤活性的手段。
2、rna表观遗传修饰，特别是rna编辑和甲基化修饰，具有非常重要的基因调控功能。a-to-i rna编辑是哺乳动物转录组中最广泛分布的一种修饰类型。adar1是行使这一重要rna修饰类型的催化酶。adar1通过结合蛋白编码基因或者非编码序列的双链rna区域，将腺苷
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有nk杀伤实体瘤的功能不足而提供一种功能增强型nk细胞的制备方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供一种功能增强型nk细胞的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)构建rna编辑酶敲降质粒；
5、(2)将步骤(1)所述的rna编辑酶敲降质粒、包装质粒和包膜质粒转染至293t细胞中培养，培养后收集细胞上清液，获得病毒液；
6、(3)将步骤(2)所述病毒液与nk细胞进行孵育，孵育后收集细胞，获得功能增强型nk细胞。
7、本专利技术首次在临床黑色瘤患者外周血标本中通过流式检测的手段证实，rna编辑酶尤其是rna编辑酶adar1在实体瘤特别是黑色素瘤患者的nk细胞中高表达，且与nk的免疫抑制受体表达呈正相关关系。因此，为了获得一种功能增强型nk细胞，本专利技术通过构建包含rna编辑酶敲低的质粒，该方法能够利用慢病毒转染技术将rna编辑酶敲低的质粒整合到nk细胞的基因组中，最终获得性能增强的nk细胞。
8、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述rna编辑酶敲降质粒为rna编辑酶adar1敲降质粒。rna编辑酶adar1是一种能够执行a-to-irna编辑的rna酶，通过结合蛋白编码基因或者非编码序列的双链rna区域，将腺苷(a)脱氨基转变为肌苷(i)。adar1会对特定的内源性的双链rna进行a-to-i编辑，内源双链rna被编辑之后，在细胞质中就不会被mda5识别为“非己”，防止了激活内源双链rna的免疫反应。因此，adar1介导的非编码区rna编辑在先天免疫系统中起了负调控作用，不利于抗肿瘤治疗。本专利技术通过构建rna编辑酶adar1敲降质粒作为慢病毒系统中的穿梭质粒，转染至nk细胞，进而增强nk细胞对靶细胞的杀伤能力。
9、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述rna编辑酶adar1敲降质粒的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
10、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，所述步骤(1)包括以下步骤：将特异性识别rna编辑酶的引物序列退火后连接到plko.1质粒中，完成rna编辑酶敲降质粒的构建。本专利技术通过引物序列退火获得rna编辑酶干扰序列；plko.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导入细胞，作为常规rnai载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。一旦进入细胞整合到基因组，便可以稳定表达shrna。
11、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述包装质粒为pspax2包装质粒；所述包膜质粒为pmd2.g包膜质粒。pspax2是慢病毒包装辅助质粒,载有病毒gag、pol、rev和tat基因，是一种能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜。pmd2.g质粒是一种常用于基因克隆和表达的载体，是一种拷贝数高、稳定性好和易于操作的慢病毒包装的辅助质粒，能增强慢病毒颗粒的包膜稳定性和感染效率。
12、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述rna编辑酶敲降质粒、包装质粒和包膜质粒的转染比例为rna编辑酶敲降质粒：包装质粒：包膜质粒＝(1-3):(1-2):1；优选地，所述rna编辑酶敲降质粒、包装质粒和包膜质粒的转染比例为rna编辑酶敲降质粒：包装质粒：包膜质粒＝3:2:1。本专利技术通过该提高慢病毒三质粒系统中rna编辑酶敲降质粒的比例，提高目标基因(adar1)沉默的效率，同时协同包装质粒(pspax2)提供病毒必需的结构蛋白和酶，有利于病毒颗粒的有效组装。在该比例下能够在生产高效病毒颗粒的同时避免细胞毒性。包膜蛋白对于病毒的稳定性和靶向性至关重要，最低比例的包膜质粒(pmd2.g)可以提供病毒颗粒所需的包膜蛋白，而不至于过量导致细胞毒性。在优选的慢病毒系统质粒比例下，有助于生产高滴度的慢病毒，同时保持较高的感染效率，产生更多有效的病毒颗粒用于实验或治疗。
13、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述nk细胞为nk92细胞。
14、作为本专利技术所述方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述病毒液与nk细胞进行孵育的比例为病毒液：nk细胞＝1:1。
15、第二方面，本专利技术提供一种功能增强型nk细胞，所述功能增强型nk细胞通过一种功能增强型nk细胞的制备方法获得。
16、本专利技术通过利用含rna编辑酶adar1敲降质粒的慢病毒转染系统获得一种功能增强型nk细胞，由于减弱了adar1对nk细胞的效应功能的负本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种功能增强型NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述RNA编辑酶敲降质粒为RNA编辑酶ADAR1敲降质粒；所述RNA编辑酶ADAR1敲降质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：将特异性识别RNA编辑酶的引物序列退火后连接到pLKO.1质粒中，完成RNA编辑酶敲降质粒的构建。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包装质粒为psPAX2包装质粒；所述包膜质粒为pMD2.G包膜质粒。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RNA编辑酶敲降质粒、包装质粒和包膜质粒的转染比例为RNA编辑酶敲降质粒：包装质粒：包膜质粒＝(1-3):(1-2):1；优选地，所述RNA编辑酶敲降质粒、包装质粒和包膜质粒的转染比例为3:2:1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NK细胞为NK92细胞
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述病毒液与NK细胞进行孵育的比例为病毒液：NK细胞＝1:1。
8.一种功能增强型NK细胞，其特征在于，所述功能增强型NK细胞通过权利要求1-7任一项所述的功能增强型NK细胞的制备方法获得。
9.权利要求8所述的功能增强型NK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种功能增强型nk细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述rna编辑酶敲降质粒为rna编辑酶adar1敲降质粒；所述rna编辑酶adar1敲降质粒的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：将特异性识别rna编辑酶的引物序列退火后连接到plko.1质粒中，完成rna编辑酶敲降质粒的构建。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包装质粒为pspax2包装质粒；所述包膜质粒为pmd2.g包膜质粒。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述rna编辑酶敲降...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琪，陈树翰，刘秋莉，陆地，梁汝康，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：
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