【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域中，一种用于检测rarg融合基因的引物探针组合与试剂盒及应用。
技术介绍
1、急性髓系白血病(aml)是一类起源造血干/组细胞的血液系统恶性肿瘤，约占成人急性白血病的80％，现有治疗手段主要包括化疗和造血干细胞移植(hsct)。美国最新seer数据显示aml的5年存活率仅为29.5％，aml是严重威胁人民健康的重大疾病,因此aml的精准诊疗成为国际研究的重点。aml是一组高度异质性的疾病。欧洲白血病网络(eln)和美国国立综合癌症网络(nccn)指南根据分子遗传学结果，将aml分为预后良好、中等、不良三组，以此为基础的分子分型诊疗策略成功改善了部分患者的预后。随着以二代测序技术的出现和快速应用，发现了越来越多的分子异常，进而认识了更多的aml亚型，迄今为止，根据最新第4版《who造血和淋巴组织肿瘤分类》，已定义了19种aml亚型，成为目前国际该领域的最权威的分型标准。
2、然而，who分型并非解决了所有诊断分型问题，它是一个开放的系统，有待新的类型被发现并补充。近年来申请人发现一类特殊aml病人，其临床表现、出凝血检查、骨髓形态学和免疫分型和急性早幼粒细胞白血病(apl)非常相似，分子遗传学检测无t(15；17)/pml-rara和其它rara重排，对维甲酸(atra)和亚砷酸(ato)治疗无效，这种病人在who分型中没有描述而无法分型，临床医生通常笼统诊断为aml进行治疗。后来通过科研手段利用rna-seq方法，才发现这类病人存在维甲酸γ受体(rarg)和其它基因发生融合，并且随着rna-
3、从现有的数据看，rarg-aml和apl从临床表现和常规检查结果上难以鉴别。rarg-aml病人临床也是以出凝血异常为主伴有原发性纤溶亢进，两系或三系减少常见，骨髓形态学可见颗粒增多的异常早幼粒细胞为主并且pox强阳性，免疫分型表现为典型apl的特征cd34-hla-dr-cd11b-cd117+cd13+cd33+mpo+。从快速诊断角度fish方法具有重要的意义，如果拟诊apl病人没有检测到17号染色体异常，基本上可以排除经典和变异性型apl，需要及时启动rna-seq测序。但是由于目前rna-seq测序主要为科研服务、检测费用相对较高、检测结果回报时间较长(2-3周以上)，限制了其临床推广应用，导致多数rarg-aml病例被漏诊或误诊。从已经发表的rarg-aml病例看，从初诊到明确诊断的时间平均50天(19天-32个月)。因此亟需开发一套快速多重pcr试剂盒，把各种rarg融合基因进行快速筛查。
4、rarg融合基因快速筛查的临床意义还体现在：1)指导临床用药：因为rarg-aml对维甲酸和亚砷酸均耐药，如果不能准确诊断，会导致疾病加重乃至死亡。一旦确诊rarg-aml立刻改变治疗方案为标准的化疗方案(da方案、ia方案、ha方案)，使得患者获得缓解接收后续治疗。2)提供微小残留病(mrd)监测指标：融合基因为白血病细胞特有，是理想的mrd监测分子标志，能够特异敏感地反映白血病负荷、指导临床尽早采取干预措施预防复发。因此rarg融合基因快速筛查临床意义重大。
5、融合基因筛查可采用转录组测序技术，它尽管具有覆盖全面等优点，但是其应用于临床常规尚存在分析过程繁琐复杂、费时等问题，因而在寻找未知类型方面更具优势。相比之下，实时定量pcr(rq-pcr)与多重pcr相结合的多重rq-pcr技术是适用于临床常规的筛查特定融合基因类型的检测技术。
6、文献报道及申请人的前期工作显示，国际上共报道了35例rarg-aml，共有7种rarg融合基因类型(nup98-rarg,pml-rarg,cpsf6-rarg,hnrnpc-rarg，hnrnpm-rarg，npm1-rarg，sart3-rarg)。但是各类型之间的发生率差异很大。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何检测rarg融合基因，以及如何筛查rarg-aml患者。
2、为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测rarg融合基因的引物探针组合，所述引物探针组合包括引物1-12与探针1-3，所述引物1-12分别为序列表中seq idno.1-12所示的12条单链dna，所述探针1-3的序列分别为序列表中seq id no.13、14和15。
3、上述引物探针组合中，所述探针1-3的两端均可分别标记荧光基团(如fam)与荧光淬灭基团(如tamra)。
4、上述引物探针组合还可包括内参的引物与探针，所述内参的引物可为引物13-14，所述引物13-14分别为序列表中seq id no.16-17所示的2条单链dna；所述探针可为探针4，所述探针4的序列为序列表中序列表中seq id no.18。
5、所述探针4的两端均可分别标记荧光基团(如fam)与荧光淬灭基团(如tamra)。
6、上述引物探针组合可仅由所述引物1-12与所述探针1-3组成，还可由所述引物1-12、所述探针1-3、所述引物13-14与所述探针4组成。
7、上述引物探针组合中，各引物与探针均可独立包装，也可包装在一起。上述引物探针组合中，各引物的摩尔数均可相等，各探针的摩尔数均可相等，每条引物与每条探针的摩尔比可为3:2。
8、本专利技术还提供了一种检测rarg融合基因的试剂盒，所述试剂盒含有所述引物探针组合。
9、本专利技术还提供了所述引物探针组合或所述试剂盒的下述任一应用：
10、x1)检测或辅助检测rarg融合基因；
11、x2)制备检测或辅助检测rarg融合基因的产品；
12、x3)制备筛查或辅助筛查rarg-aml患者的产品；
13、x4)制备筛查或辅助筛查非rarg-aml患者的产品；
14、x5)制备诊断或辅助诊断rarg-aml患者的产品。
15、其中，检测rarg融合基因可为非诊断目的的检测rarg融合基因。
16、所述rarg融合基因为cpsf6-rarg(即cpsf6基因与rarg基因的融合基因)，hnrnpc-rarg(即hnrnpc基因与rarg基因的融合基因)，hnrnpm-rarg(即hnrnpm基因与rarg基因的融合基因)，npm1-rarg(即npm1基因与rarg基因的融合基因)，nup98-rarg(即nup98基因与rarg基因的融合基因)，pml-rarg(即pml基因与rarg基因的融合基因)和/或sart3-rarg(即sart3基因与rarg基因的融合基因)。
17、本专利技术还提供了下述任一引物探针组合：
18、p1)用于检测cpsf6-rarg融合基因的引物探针组合，包括引物1-2、10-12与探针1-3，所述引物1-2、10-12分别为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测RARG融合基因的引物探针组合，包括引物1-12与探针1-3，所述引物1-12分别为序列表中SEQ ID No.1-12所示的12条单链DNA，所述探针1-3的序列分别为序列表中SEQ ID No.13、14和15。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述探针1-3的两端均分别标记荧光基团与荧光淬灭基团。
3.检测RARG融合基因的试剂盒，含有权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂盒的下述任一应用：
5.下述任一引物探针组合：
6.根据权利要求5所述的引物探针组合，其特征在于：所述探针1-3的两端均分别标记荧光基团与荧光淬灭基团。
7.下述任一试剂盒：
8.下述R1)-R7)中任一应用：
【技术特征摘要】
1.用于检测rarg融合基因的引物探针组合，包括引物1-12与探针1-3，所述引物1-12分别为序列表中seq id no.1-12所示的12条单链dna，所述探针1-3的序列分别为序列表中seq id no.13、14和15。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述探针1-3的两端均分别标记荧光基团与荧光淬灭基团。
3.检测rarg融合基...
【专利技术属性】
技术研发人员：主鸿鹄，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：
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