【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞检测，特别是涉及一种脐带间充质干细胞huc-mscs干性基因蛋白表达水平的定性检验方法。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stromal/stem cell，msc)，是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)，具有多向分化潜能，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列的细胞分化潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。
2、间充质干细胞的多能性(multipotent)是指具有形成机体内超过一种类型细胞的能力，在体外可诱导分化为骨和脂肪等多种功能细胞，并能表达调控细胞向其他组织细胞类型或器官分化的基因特性(如ssea-4、oct-4、sox-2和nanog基因均为多能性基因)。间充质干细胞是以细胞分裂的方式产生新细胞的特性，包括细胞周期中各不同阶段所占比例以及细胞分裂过程中细胞数量随时间变化的特征。需要对脐带间充质干细胞干性基因蛋白表达水平进行检测，以把控间充质干细胞的质量要求。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞huc-mscs干性基因蛋白表达水平的定性检验方法，定性检测脐带间充质干细胞的干性基因蛋白表达水平，把控间充质干细胞的质量。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞huc-mscs干性基因蛋白表达水平的定性检验方法，包
4、1)将脐带间充质干细胞接种于细胞培养板内培养，待细胞达到30～50％汇合时，弃去培养基、润洗，得到润洗培养板；
5、2)将所述步骤1)得到的润洗培养板使用多聚甲醛固定、润洗，得到固定培养板；
6、3)将所述步骤2)得到的固定培养板使用tritonx-100进行透膜处理、润洗，得到透膜培养板；
7、4)将所述步骤3)得到的透膜培养板使用山羊血清封闭，弃去液体加入干性基因的抗体进行避光孵育、润洗后，加入二抗后进行孵育、润洗，得到孵育培养板；
8、5)将所述步骤4)得到的孵育培养板进行核染、避光孵育，清洗后加入缓冲液，进行荧光显微观察；
9、所述干性基因包括ssea-4基因、oct-4基因、sox-2基因和nanog基因中的一种或多种。
10、优选的，所述步骤1)脐带间充质干细胞的接种密度为：24孔板，5×103/孔，细胞长至30％～50％时进行实验。
11、优选的，所述步骤2)使用多聚甲醛溶液进行固定，所述多聚甲醛溶液的质量百分含量为4％；
12、所述固定的时间为20min，温度为20～30℃。
13、优选的，所述步骤3)使用tritonx-100溶液进行透膜处理，所述tritonx-100溶液的质量百分含量为0.25％；
14、所述透膜处理的时间为20min，温度为20～30℃。
15、优选的，所述步骤4)使用山羊血清溶液封闭，所述山羊血清溶液的体积百分含量为10％；
16、所述封闭的时间为30min，温度为20～30℃。
17、优选的，所述步骤4)抗体包括鼠抗人ssea-4单克隆抗体、兔抗人oct-4多克隆抗体、兔抗人sox-2多克隆抗体或兔抗人nanog单克隆抗体；所述抗体均用pbs缓冲液稀释；
18、所述兔抗人sox-2多克隆抗体与pbs的体积比为1:1000；
19、所述兔抗人oct-4多克隆抗体与pbs的体积比为1:1000；
20、所述兔抗人nanog单克隆抗体与pbs的体积比为1:500；
21、所述鼠抗人ssea-4单克隆抗体与pbs的体积比为1:70-100；
22、所述二抗包括荧光素标记的山羊抗兔igg抗体和荧光素标记的山羊抗鼠igg抗体；所述二抗均用pbs缓冲液稀释；
23、所述荧光素标记的山羊抗兔igg抗体与pbs的体积比为1:200；
24、所述荧光素标记的山羊抗鼠igg抗体与pbs的体积比为1:200。
25、优选的，所述步骤4)避光孵育的时间为12h，温度为4℃；
26、所述孵育的时间为2h，温度为4℃。
27、优选的，所述步骤5)使用dapi或pi进行核染；
28、所述避光孵育的时间为20min，温度为20～30℃。
29、优选的，使用pbs缓冲液进行润洗，次数为3次。
30、优选的，所述pbs缓冲液的组分包括nacl 8g/l、na2hpo4·12h2o 2.9g/l、kcl0.2g/l和kh2po4 0.2g/l。
31、本专利技术的检测机理为：
32、借助抗原抗体结合原理，先利用鼠或兔源抗人ssea-4、oct-4、sox-2和nanog的单克隆抗体(mcab)或多克隆抗体(pcab)与脐带间充质干细胞反应，洗去未结合mcab/pcab，如使用pcab则用带荧光的二抗进行染色，经反应并洗涤后，荧光显微镜下观察荧光强度来判断抗原的表达情况。
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1.一种脐带间充质干细胞hUC-MSCs干性基因蛋白表达水平的定性检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤1)脐带间充质干细胞的接种密度为：24孔板，5×103/孔，细胞长至30％～50％时进行实验。
3.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤2)使用多聚甲醛溶液进行固定，所述多聚甲醛溶液的质量百分含量为4％；
4.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤3)使用TritonX-100溶液进行透膜处理，所述TritonX-100溶液的质量百分含量为0.25％；
5.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤4)使用山羊血清溶液封闭，所述山羊血清溶液的体积百分含量为10％；
6.据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤4)抗体包括鼠抗人SSEA-4单克隆抗体、兔抗人OCT-4多克隆抗体、兔抗人SOX-2多克隆抗体或兔抗人NANOG单克隆抗体；所述抗体均用PBS缓冲液稀释；
7.据权利要求1所述的定性检验
8.据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤5)使用DAPI或PI进行核染；
9.据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，使用PBS缓冲液进行润洗，次数为3次。
10.据权利要求9所述的定性检验方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的组分包括NaCl8g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KCl 0.2g/L和KH2PO4 0.2g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞huc-mscs干性基因蛋白表达水平的定性检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤1)脐带间充质干细胞的接种密度为：24孔板，5×103/孔，细胞长至30％～50％时进行实验。
3.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤2)使用多聚甲醛溶液进行固定，所述多聚甲醛溶液的质量百分含量为4％；
4.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤3)使用tritonx-100溶液进行透膜处理，所述tritonx-100溶液的质量百分含量为0.25％；
5.根据权利要求1所述的定性检验方法，其特征在于，所述步骤4)使用山羊血清溶液封闭，所述山羊血清溶液的体积百分含量为10％；
...【专利技术属性】
技术研发人员：里程，郭镭，
申请(专利权)人：圣释北京生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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