【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胚胎培养，具体涉及一种超疏水纳米涂层3d培养皿及其细胞培养方法。
技术介绍
1、试管婴儿技术中，女方经过促排卵获得一定数量的卵子，男方获取一定的精子，精子和卵子结合后形成受精卵，经过3-5天的体外培养形成早期胚胎，再移植到女性子宫内。在体外培养的过程，卵母细胞及胚胎置于塑料培养皿中培养（原材料为聚苯乙烯），技术人员事先在培养皿中有序滴入胚胎培养微滴，每个微滴约20ul-30ul，然后在液滴表面覆盖培养矿物油，作为物理屏障阻断培养液滴和环境以及空气种微粒和病菌之间的结合从而防止污染，并防止微滴挥发和减慢气体扩散使微滴ph值、渗透压、温度湿度保持稳定，防止胚胎培养微环境过大波动。但在制作培养微滴过程中，步骤是事先在培养皿中滴入数个微滴，再覆盖油，覆盖培养油之前，微滴粘附于塑料培养皿之上且暴露在空气中，而且微滴小，很容易挥发，在整个培养过程中液滴也是始终紧紧粘附于培养皿之上。培养胚胎所使用的培养皿主要材料为聚苯乙烯，其表面有一定的亲水性，甚至有的培养皿为培养普通细胞为确保贴壁细胞很好地贴附皿表面，引入亲水因子，使其生长于繁殖。但胚胎的外表包绕着透明带，其并非是贴壁生长。
2、在普通组织细胞培养中，传统的下包培养模式2d培养：细胞都粘附在二维平面上，但无法模拟体内细胞与细胞，细胞与外基质的相互作用，使细胞形态、存活力、增殖、分化、基因和蛋白表达。而3d培养可以模拟细胞生长生理学相关机制，目前3d培养技术的发展分为无支架的3d培养和有支架的3d培养，无支架的3d培养第一种为悬滴培养，在平板小孔滴加液体,利用液体表
3、有支架的3d培养是利用支架可以机械支持作用，帮助细胞承受外部压力,并为再生的组织提供结构支撑。其应用具有一定的普遍性，但相对本设计来讲，有支架的3d细胞培养系统一是需要使用特定的支架或基质，并需要了解和控制细胞和支架之间的相互作用以及培养环境的参数，设备、技术和操作都更加复杂；二是资源和维护成本高需要更多的培养基、生长因子和支架等资源；三是在支架包裹的三维结构中，营养和氧气的扩散速度相对较慢，导致细胞的增殖速度较慢因此需要更多的维护和耗费成本；四是有一些支架材料如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚己内酯等脂肪族聚酯亲水性差、对细胞的黏附性较弱,易引发无菌性炎症；此外支架属于外源性物质，对胚胎的后期发育影响可能有潜在的影响。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种超疏水纳米涂层3d培养皿及非贴壁生长细胞培养方法，解决现有技术中培养液在覆盖培养油之前，培养液粘附于塑料培养皿之上且暴露在空气中，致使不可避免的培养液挥发，导致ph值、渗透压、温度湿度不稳定影响培养效果。
2、为实现上述技术目的，本专利技术提出如下技术方案：一种超疏水纳米涂层d培养皿，包括培养皿体、培养皿底板和覆盖培养皿体的上盖，所述培养皿底板上围绕培养皿底板的圆心开设有多个半球状小凹槽，培养皿底板上小凹槽的外围开设有与小凹槽数量相适配的大凹槽，养皿底板上大凹槽的外围开设有环形槽，小凹槽、大凹槽以及环形槽的内表面均设有超疏水纳米涂层，培养皿体和培养底板为一体化结构。
3、进一步的，所述大凹槽的内径较小凹槽内径大。
4、进一步的，所述培养皿底板上的小凹槽和大凹槽的边缘处分别设有数字编号和字母编号。
5、进一步的，所述环形槽内通过多个挡板将环形槽均匀分割为与小凹槽数量相适配的弧形槽，所述弧形槽的外围边缘处开设有数字编号。
6、进一步的，所述培养皿底板上且位于环形槽的外围设有溢流壁，溢流壁的高度较培养皿体的高度低。
7、进一步的，一种超疏水纳米涂层d培养皿的培养方法，包括如下步骤：①先用巴氏管或移液器在培养皿的培养皿底板上加入培养油，培养油的添加量以没过培养液滴为准，培养油在培养皿体内形成一层油膜；
8、②再使用新的巴氏管或加样枪吸入适量的培养液，通过步骤①的油层伸入小凹槽、弧形槽和大凹槽内，向大凹槽内释放受精培养液，向小凹槽、弧形槽内释放卵裂液培养液，在小凹槽内的卵裂液培养液形成卵裂液培养液微滴悬浮在小凹槽内，在弧形槽释放多次卵裂液培养液，每次10-20ul形成多个卵裂液培养液液滴悬浮在弧形槽内，在大凹槽内的受精培养液形成受精培养液液滴悬浮在大凹槽内；
9、③将步骤②的培养皿放入5～6%浓度的二氧化碳培养箱中预温平衡；
10、④不孕患者手术取出卵冠丘复合体后并洗涤干净，从培养箱中拿出平衡好的培养皿，使用巴氏管吸取卵冠丘复合体并穿过步骤①的培养油油层向步骤②大凹槽内受精培养液液滴中放入一枚卵冠丘复合体；
11、⑤将步骤④中的培养皿放入5～6%co2、37℃培养箱中孵育2-4个小时后授精，向每个含有卵冠丘复合体的大凹槽中加入浓度为5000-10000条/ml的精子，并放回培养箱中继续孵育4-6小时；
12、⑥将步骤⑤的培养皿从培养箱中取出并用剥卵针轻柔的吹吸，去除卵母细胞周围的颗粒细胞，在倒置显微镜下观察卵母细胞第二极体排出情况，若观察到卵母细胞排出第二极体，用毛细吸管将去除颗粒细胞的卵母细胞由大凹槽中转移至弧形槽中洗涤，洗涤后使用巴氏管将受精的卵母细胞移入小凹槽中，每个小凹槽内的卵裂液培养液微滴中放一个受精的卵母细胞。
13、进一步的，步骤①培养油加入的高度均高于步骤②小凹槽内卵裂液培养液微滴、弧形槽内卵裂液培养液滴液以及大凹槽内受精培养液液滴的高度，确保小凹槽内卵裂液培养液微滴、弧形槽内的卵裂液培养液液滴以及大凹槽受精培养液液滴完全浸没在培养油内。
14、进一步的，步骤⑥中用巴氏管对卵母细胞进行吹吸，将受精卵母细胞在弧形槽内的卵裂液培养液中一个卵裂液培养液液滴转移到另一个卵裂液培养液液滴中，重复多次转移。
15、进一步的，步骤⑥中用毛细吸管将卵母细胞由大凹槽中转移至弧形槽的过程中，毛细细管的底部不离开培养油油层；步骤⑥中使用巴氏管将洗涤后的受精卵母细胞移入小凹槽中时，巴氏管的底部不离开培养油油层。
16、进一步的，步骤③的平衡时间为4个小时以上。
17、与现有技术相比，本专利技术产生的有益效果是：本专利技术结构新颖，构思巧妙，操作简单方便，和现有技术相比具有以下优点：本专利技术较其他3d培养方法简单,易操作，通过弧形槽、小凹槽、大凹槽和超疏水纳米涂层，分别将卵裂液培养液固定在弧形槽和小凹槽内作为清洗液及培养液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超疏水纳米涂层3D培养皿，其特征在于：包括培养皿体（1）、培养皿底板（2）和覆盖培养皿体（1）的上盖，所述培养皿底板（2）上围绕培养皿底板（2）的圆心开设有多个半球状小凹槽（3），培养皿底板（2）上小凹槽（3）的外围开设有与小凹槽（3）数量相适配的大凹槽（4），养皿底板（2）上大凹槽（4）的外围开设有环形槽（5），小凹槽（3）、大凹槽（4）以及环形槽（5）的内表面均设有超疏水纳米涂层（6），培养皿体（1）和培养底板（2）为一体化结构。
2.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿，其特征在于：所述大凹槽（4）的内径较小凹槽（3）内径大。
3.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿，其特征在于：所述培养皿底板（2）上的小凹槽（3）和大凹槽（4）的边缘处分别设有数字编号和字母编号。
4.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿，其特征在于：所述培养皿底板（2）上且位于环形槽（5）的外围设有溢流壁（13），溢流壁（13）的高度较培养皿体（1）的高度低。
5.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿
6.根据权利要求5所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿的细胞培养方法，其特征在于：包括如下步骤：①先用巴氏管或移液器在培养皿的培养皿底板（2）上加入培养油（9），培养油（9）在培养皿体（1）内形成一层油膜；
7.根据权利要求6所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿的细胞培养方法，其特征在于：步骤①培养油（9）加入的高度均高于步骤②小凹槽（3）内卵裂液培养液微滴（10）、弧形槽（8）内卵裂液培养液滴液（11）以及大凹槽（4）内受精培养液液滴（12）的高度，确保小凹槽（3）内卵裂液培养液微滴（10）、弧形槽（8）内的卵裂液培养液液滴（11）以及大凹槽（4）受精培养液液滴（12）完全浸没在培养油（9）内。
8.根据权利要求6所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿的细胞培养方法，其特征在于：步骤⑥中用巴氏管对卵母细胞（14）进行吹吸，将受精卵母细胞（14）在弧形槽（8）内的卵裂液培养液中一个卵裂液培养液液滴（11）转移到另一个卵裂液培养液液滴（11）中，重复多次转移。
9.根据权利要求6所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿的细胞培养方法，其特征在于：步骤⑥中用毛细吸管将卵母细胞（14）由大凹槽（4）中转移至弧形槽（8）的过程中，毛细细管的底部不离开培养油（9）油层；步骤⑥中使用巴氏管将洗涤后受精的卵母细胞（14）移入小凹槽（3）中时，巴氏管的底部不离开培养油油层。
10.根据权利要求6所述的一种超疏水纳米涂层3D培养皿的细胞培养方法，其特征在于：步骤③的预温平衡时间为4个小时以上。
...【技术特征摘要】
1.一种超疏水纳米涂层3d培养皿，其特征在于：包括培养皿体（1）、培养皿底板（2）和覆盖培养皿体（1）的上盖，所述培养皿底板（2）上围绕培养皿底板（2）的圆心开设有多个半球状小凹槽（3），培养皿底板（2）上小凹槽（3）的外围开设有与小凹槽（3）数量相适配的大凹槽（4），养皿底板（2）上大凹槽（4）的外围开设有环形槽（5），小凹槽（3）、大凹槽（4）以及环形槽（5）的内表面均设有超疏水纳米涂层（6），培养皿体（1）和培养底板（2）为一体化结构。
2.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3d培养皿，其特征在于：所述大凹槽（4）的内径较小凹槽（3）内径大。
3.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3d培养皿，其特征在于：所述培养皿底板（2）上的小凹槽（3）和大凹槽（4）的边缘处分别设有数字编号和字母编号。
4.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3d培养皿，其特征在于：所述培养皿底板（2）上且位于环形槽（5）的外围设有溢流壁（13），溢流壁（13）的高度较培养皿体（1）的高度低。
5.根据权利要求1所述的一种超疏水纳米涂层3d培养皿，其特征在于：所述环形槽（5）内通过多个挡板（7）将环形槽（5）均匀分割为与小凹槽（3）数量相适配的弧形槽（8），所述弧形槽（8）的外围边缘处开设有数字编号。
6.根据权利要求5所述的一种超疏水纳米涂层3d培养皿的细胞培养方法，其特征在于：包...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐鸿毅，张颖，陈鑫，田佳蓉，张鑫，李欣，席园园，付奎，
申请(专利权)人：十堰市人民医院湖北医药学院附属人民医院，
类型：发明
国别省市：
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