【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测试剂技术、体外诊断，尤其涉及凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒。
技术介绍
1、血栓是一种起病隐匿、发病突然、致死致残率较高的疾病，可见于几乎各临床科室，其病理过程涉及血管内皮、凝血和纤溶三大系统。研究已经证实机体处于血栓前状态时，血管内皮、凝血和纤溶系统已经发生改变。血栓与止血(俗称凝血)体外诊断可以有效帮助医生分析血栓和出血形成的原因，对包括心脑血管疾病在内的血栓性疾病以及出血性疾病等进行预防、筛查、诊断和监测，可以用于评估血栓风险，指导对心脑血管疾病的预防过程，还可以用于手术前凝血功能障碍筛查，了解患者的凝血功能障碍情况。对于医院和庞大患者群体来说，凝血分析有很大的发展空间。
2、常规凝血四项包括pt、aptt、tt、act，这些检测项目可反映凝血途径的过程、判断出血风险及进行抗凝药物监测，但无法反映血栓前状态、pre-dic早期预防及进行溶栓效果的疗效监测，为此临床需要一种能够反映血栓早期形成的标志物。且常规的凝血四项在凝血过程的监测中，除非凝血后期消耗了大量纤维蛋白原，结果才可能出现异常，而出现异常时已在疾病进展的中、晚期；而d-二聚体(d-d)及纤维蛋白(原)降解产物(fdp)则是血栓的降解产物，出现时已为纤溶亢进期，病程远远落后于凝血期。
3、新血栓四项(tat、pic、tm、tpai.c)是反应机体血管内皮、凝血和纤溶系统早期改变的有效指标，强调凝血(血栓形成)，与d-d、fdp联合检测，可第一时间、更加敏感、可靠地向临床反馈血栓的发生与形成、术后血栓形成与出血情况的监控
4、其中，新血栓四项的检测目标对象及其作为检测指标的原理如下：
5、抗凝血酶ⅲ是抗凝系统中最重要的成分，是体内重要的天然抗凝蛋白,属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员，它是由肝脏和内皮细胞合成的一种多功能的丝氨酸蛋自酶抑制物，可抑制凝血酶的活性并抑制促凝血酶生成的凝血因子,具有强大的抗凝活性，占血浆抗凝酶活性的70％。因凝血酶在生理情况下生成极少且很快被抗凝血酶以1：1共价结合生成凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物(tat)而灭活，以维持内环境稳定，故很难直接检测凝血酶的含量。血浆中检出tat反映了凝血酶的生成和凝血酶活性的增高，因此tat是人体内凝血和抗凝血相互作用以维持生理平衡的产物，是凝血酶生成的标志物之一。
6、由于血栓四项检测的需求量大，当前针对新血栓四项检测的技术和市销试剂盒产品的类型还较为有限，因此，如何保证检测可靠性的情况下，提供新的检测方法或检测试剂盒是非常具有积极现实意义的课题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种用于凝血酶-抗凝血酶ⅲ(tat)检测，且实施可靠、应用便利、检测结果参考性佳的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒。
2、为了实现上述的技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：
3、一种链霉亲和素磁珠的制备方法，其包括：
4、s1、水热法制备fe3o4 nps：将1.35g fecl3·6h2o溶于40ml乙二醇中搅拌30min，在搅拌过程中，在混合物中加入3.6g无水醋酸钠和1.1g peg，加热至60℃至完全溶解，当混合物中固形物完全溶解时，得到颜色为黄色的混合溶液，将混合溶液转移到高压灭菌器中，在200℃下反应6h，制得fe3o4粉末；然后在外加磁场作用下，将fe3o4粉末收集富集，再分别用乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后将fe3o4粉末在60℃的干燥箱中干燥12h；
5、s2、au seed nps的制备：将1ml,1wt％柠檬酸钠水溶液和3ml,0.1m nabh4水溶液加入到99ml,0.01wt％haucl4·4h2o水溶液中，可见溶液迅速变红，然后在搅拌条件下反应4h，得到au seed nps；
6、s3、fe3o4@au seed的制备：取0.05g fe3o4 nps加入到30ml水溶液中，获得混合溶液，然后将0.1g 1mg/ml的聚乙烯亚胺pei预先溶解在10ml无水乙醇中，再加入至混合溶液内，并对其进行持续超声2h，再使用去离子水将其洗涤三次，制得氨基化的fe3o4 nps，即fe3o4@pei nps，然后将25ml au seed nps溶液加入到氨基化的fe3o4 nps当中，然后进行超声1h，获得fe3o4@au seed nps，再使用去离子水对所制备的fe3o4@au seed nps进行磁选洗涤三次，并稀释成25ml的fe3o4@au seed nps溶液；
7、s4、fe3o4@au制备：使用种子原位生长法，将5ml fe3o4@au seed粉末与50ml溶液相互混合，该溶液包含mw＝4000的150mg pvp和25mg 0.5ml/ml盐酸羟胺，然后将混合溶液进行超声反应15min，待搅拌并超声均匀后，往其中加入2.5ml,1wt％haucl4·4h2o，再超声30min，最后使用去离子水洗涤三次，稀释为10ml fe3o4@au nps溶液，然后放置于冰箱备用；
8、s5、将步骤s4制得的fe3o4@au nps与链霉亲和素混合，然后在预设温度下搅拌12h，再经离心后，取沉淀物，制得链霉亲和素磁珠。
9、基于上述，本专利技术还提供上述所述制备方法所制得的链霉亲和素磁珠在凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒制备中的应用。
10、基于上述，本专利技术还提供一种凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒，其包括：ra试剂、rb试剂；其中，所述ra试剂包括权利要求1制备方法所制得的链霉亲和素磁珠和经生物素标记的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物抗体，所述凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物抗体被所述链霉亲和素磁珠包被；
11、所述rb试剂包括经碱性磷酸酶标记的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物抗体。
12、作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案所述ra试剂的工作液由ph为7.0-8.0，浓度为0.01mol/l-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液中的一种配制而成，所述ra试剂的工作液还含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.05～0.5wt％的tween-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。
13、作为一种较优的选择实施方式，优选的，本方案所述rb试剂的工作液由ph为7.0-8.0，浓度为0.01mol/l-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液中的一种配制而成，所述rb试剂的工作液还含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.5～1wt％的d-海藻糖、1～10wt％的蛋白稳定剂、0.05～0.5wt％的tween-20和/或triton x-100本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于：其包括：
2.如权利要求1所述制备方法所制得的链霉亲和素磁珠在凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒制备中的应用。
3.一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，其包括：Ra试剂、Rb试剂；其中，所述Ra试剂包括权利要求1制备方法所制得的链霉亲和素磁珠和经生物素标记的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗体，所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗体被所述链霉亲和素磁珠包被；
4.如权利要求3所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述Ra试剂的工作液由pH为7.0-8.0，浓度为0.01mol/L-0.1mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液中的一种配制而成，所述Ra试剂的工作液还含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.05～0.5wt％的Tween-20、0.05～0.5wt％的ProClin300和/或叠氮钠。
5.如权利要求3所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述Rb试剂的工作液由pH为7.0-8.0，浓度为0.01mol/L-0
6.如权利要求3所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述Ra试剂包括含有链霉亲和素磁珠的磁珠原液、经生物素标记的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗体、Ra工作液、封闭液和阻断剂。
7.如权利要求5所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述Rb试剂包括经碱性磷酸酶标记的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗体和Rb工作液。
8.如权利要求3至7之一所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，其还包括校准品和质控品；所述校准品和质控品的工作液由pH为7.0-8.0，浓度为0.01mol/L-0.1mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液中的一种配制而成，其还含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.5～1wt％的D-海藻糖、0.05～0.5wt％的Tween-20和/或Triton X-100、0.05～0.5wt％的ProClin300和/或叠氮钠、2.5～5wt％的丙三醇。
...【技术特征摘要】
1.一种链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于：其包括：
2.如权利要求1所述制备方法所制得的链霉亲和素磁珠在凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒制备中的应用。
3.一种凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，其包括：ra试剂、rb试剂；其中，所述ra试剂包括权利要求1制备方法所制得的链霉亲和素磁珠和经生物素标记的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物抗体，所述凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物抗体被所述链霉亲和素磁珠包被；
4.如权利要求3所述的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述ra试剂的工作液由ph为7.0-8.0，浓度为0.01mol/l-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液中的一种配制而成，所述ra试剂的工作液还含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.05～0.5wt％的tween-20、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。
5.如权利要求3所述的凝血酶-抗凝血酶ⅲ复合物检测试剂盒，其特征在于，所述rb试剂的工作液由ph为7.0-8.0，浓度为0.01mol/l-0.1mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液中的一种配制而成，所述rb试剂的工作液还含有0.5～5wt％...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽，林玉影，章丽丽，吴云燕，肖南香，
申请(专利权)人：福州汉佰康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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