一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法技术

技术编号：41205409 阅读：7 留言：0更新日期：2024-05-07 22:31

本发明专利技术公开了一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，通过构建表达质粒pMA5‑NK，将其转化到枯草芽孢杆菌WB800中，得到重组枯草芽孢杆菌菌株。将基因工程菌接种至种子培养基中进行种子活化，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10~15 g/L，酵母提取物20~25 g/L，K<subgt;2</subgt;HPO<subgt;4</subgt;1~5 g/L，KH<subgt;2</subgt;PO<subgt;4</subgt;1~5 g/L，甘油4~8 g/L，pH值为6.0~8.0；将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵菌液，发酵培养基包括如下组分：乳糖10~15 g/L，糖蜜10~15 g/L，豆粕粉10~15 g/L，蛋白胨10~15 g/L，K<subgt;2</subgt;HPO<subgt;4</subgt;1~2 g/L，KH<subgt;2</subgt;PO<subgt;4</subgt;1~2 g/L，MgSO<subgt;4</subgt;0.5~1 g/L，CaCl<subgt;2</subgt;0.2~1 g/L，ZnSO<subgt;4</subgt;0.01~0.05 g/L，pH值为pH值为6.0~8.0。本发明专利技术通过发酵后期添加氨基酸和食品级吐温‑80，使纳豆激酶的产酶量达到9763.8 IU/mL，为纳豆激酶的生产的提供了新方法，具有广阔应用前景。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物发酵工程，具体涉及一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法。

技术介绍

0、技术背景

1、纳豆激酶(nattokinase，nk)是由纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，1987年，日本学者须见洋行等人首次从纳豆中分离得到。

2、研究表明纳豆激酶具有较高的纤溶活性，可以用来预防和治疗血栓疾病，是目前国内外溶栓药物的研究热点。与传统的溶栓药物相比，纳豆激酶具有安全可靠、成本低、生产工艺简单、可以口服、可通过消化道直接吸收等多种优点，因此，纳豆激酶作为新型治疗心脑血管疾病的药物，具有更多的优势，开发前景也更为广阔。

3、目前对于纳豆激酶的研究有很多，但纳豆激酶需求量大，产量低、成本高的特点阻碍其广泛应用。提高纳豆激酶产量和活性一直是推进纳豆激酶发展的重点。在专利202310342484.7《一种纳豆激酶的制备方法》中，该方法通过电导率协同游离氨基氮和/或co2释放率协同游离氨基氮浓度来反馈调控纳豆激酶的发酵生产，达到满足菌体生长需求，能够有效提高纳豆激酶生产水平，但存在工序复杂且发酵周期较长等问题。在专利202310044338.6《一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法》中，该方法提出通过加入天然组分合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖等物质刺激纳豆枯草芽孢杆菌的生长，并激活纳豆枯草芽孢杆菌产酶相关基因的表达性能，可显著提高了纳豆激酶的含量。

4、枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发

技术实现思路

1、为了解决上述
技术介绍
中存在的问题，本专利技术选取了含有强启动子phpaii的枯草芽孢杆菌表达载体pma5，用此载体成功实现了纳豆激酶的高效表达。其工艺简单，生产原料均安全可靠且成本低廉，随后通过在发酵后期加入氨基酸和食品级吐温-80并进行了发酵组分的优化，有效提高了纳豆激酶的产量。

2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：

3、一种提高纳豆激酶产量的菌种发酵工艺及其应用，包括如下步骤：

4、1)将基因工程菌接种至种子培养基中进行种子活化，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10～15g/l，酵母提取物20～25g/l，k2hpo4 1～5g/l，kh2po4

5、1～5g/l，甘油4～8g/l，ph值为6.0～8.0；

6、2)将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵菌液，发酵培养基包括如下组分：乳糖10～15g/l，糖蜜10～15g/l，豆粕粉10～15g/l，蛋白胨10～15g/l，k2hpo4 1～2g/l，kh2po4 1～2g/l，mgso4 0.5～1g/l，cacl2 0.2～1g/l，znso4 0.01～0.05g/l，ph值为6.0～8.0。

7、根据本专利技术优选的，所述步骤1)中的基因工程菌，是以来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932的纳豆激酶基因(seq id no.1)为模板，该酶的简称为nk，以pma5为载体，重组转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞wb800中获得重组纳豆激酶枯草芽孢杆菌b.subtilis wb800/pma5-nk基因工程菌。

8、本专利技术所用到的seq id no.1的序列如下：

9、seq id no.1

10、纳豆激酶基因核苷酸序列

11、

12、

13、根据本专利技术优选的，所述步骤1)中的基因工程菌的构建方法，是以来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.13932(来自于中国普通微生物菌种保藏中心)的纳豆激酶基因(seq id no.1)为模板，该酶的简称为nk，以bamhi-miui为酶切位点将nk插入到pma5载体中，得到重组表达质粒pma5-nk，将重组表达质粒pma5-nk转化到宿主细胞枯草芽孢杆菌wb800中获得枯草同源重组转化子，经过sds-page、酶活检测后获得重组纳豆激酶枯草芽孢杆菌b.subtilis wb800/pma5-nk基因工程菌。

14、根据本专利技术优选的，所述步骤1)中的种子培养基包括如下组分：蛋白胨10～15g/l，酵母提取物20～25g/l，k2hpo4 1～5g/l，kh2po4 1～5g/l，甘油4～8g/l，所述种子培养基的ph值为6.0～8.0。

15、根据本专利技术优选的，所述步骤1)中，种子活化过程中培养温度为28～40℃，摇床转速为140～220rpm，培养时间为12～18h。

16、根据本专利技术优选的，所述步骤2)中的发酵培养基包括如下组分：乳糖10～15g/l，糖蜜10～15g/l，豆粕粉10～15g/l，蛋白胨10～15g/l，k2hpo4 1～2g/l，kh2po4 1～2g/l，mgso4 0.5～1g/l，cacl2 0.2～1g/l，znso4 0.01～0.05g/l，所述发酵培养基的ph值为6.0～8.0。

17、根据本专利技术优选的，所述步骤2)中，菌株以2.5～15％的接种量接入所述发酵培养基中，培养温度为28～40℃，搅拌速度为200～800rpm，通气量为0.8～1.8vvm，发酵培养时间为18～48h。

18、根据本专利技术优选的，所述步骤2)中，在发酵起始后12～24h期间，向培养基中添加氨基酸和食品级吐温-80。

19、优选的，所述的氨基酸为亮氨酸0.2～2g/l，或甘氨酸0.2～2g/l，或天冬氨酸0.2～2g/l，或精氨酸0.2～2g/l。

20、根据本专利技术优选的，所述步骤2)中，在发酵起始后12～24h期间，向培养基中添加食品级吐温-80 0.02～0.2g/l。

21、采用上述技术方案：

22、本专利技术中，选用基因工程菌作为产酶菌株，构建了一个高效的强启动子的枯草芽孢杆菌表达系统，增加了纳豆激酶表达量。对发酵培养基的组分进行优化，并对培养条件进行调控，保证了菌株快速生长代谢所需营养条件及外部环境，提高了纳豆激酶的产量，且其工艺简单、提高了生产效率、降低了生产成本，为产纳豆激酶的基因工程菌的高密度发酵培养提供了可能，应用潜力巨大。

23、有益效果：本专利技术同现有技术相比有如下优点：

24、(1)本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：蛋白胨10~15 g/L，酵母提取物20~25 g/L，K2HPO4 1~5 g/L，KH2PO4 1~5 g/L，甘油4~8 g/L，pH值为pH值为6.0~8.0。

3.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：乳糖10~15 g/L，糖蜜10~15 g/L，豆粕粉10~15 g/L，蛋白胨10~15 g/L，K2HPO4 1~2 g/L，KH2PO4 1~2 g/L，MgSO4 0.5~1 g/L，CaCl2 0.2~1 g/L，ZnSO4 0.01~0.05 g/L，pH值为6.0~8.0。

4.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，步骤1）所述纳豆激酶基因来源于枯草芽孢杆菌CGMCC No.13932，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述

6.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，步骤2）中，种子活化过程中培养温度为28~40 ℃，摇床转速为140～220 rpm，培养时间为12～18h。

7.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，步骤3）中，菌株以2.5～15％的接种量接入所述发酵培养基中，培养温度为28~40 ℃，搅拌速度为200～800 rpm，通气量为0.8～1.8 vvm，发酵培养时间为18～48 h。

8.根据权利要求7所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，在发酵起始后12～24 h期间，向培养基中添加氨基酸和食品级吐温-80。

9.根据权利要求8所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，所述的氨基酸为亮氨酸0.2～2 g/L，或甘氨酸0.2～2 g/L，或天冬氨酸0.2～2 g/L，或精氨酸0.2～2 g/L。

10.根据权利要求8所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，食品级吐温-80的添加量为 0.02～0.2 g/L。

...

【技术特征摘要】

1.一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：蛋白胨10~15 g/l，酵母提取物20~25 g/l，k2hpo4 1~5 g/l，kh2po4 1~5 g/l，甘油4~8 g/l，ph值为ph值为6.0~8.0。

3.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：乳糖10~15 g/l，糖蜜10~15 g/l，豆粕粉10~15 g/l，蛋白胨10~15 g/l，k2hpo4 1~2 g/l，kh2po4 1~2 g/l，mgso4 0.5~1 g/l，cacl2 0.2~1 g/l，znso4 0.01~0.05 g/l，ph值为6.0~8.0。

4.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，步骤1）所述纳豆激酶基因来源于枯草芽孢杆菌cgmcc no.13932，核苷酸序列如seq id no.1所示。

5.根据权利要求1所述一种基于重组表达提高纳豆激酶产量的方法，其特征在于，步骤1）所述重组转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞为重组转化到枯草芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝宁，段雅玲，郭格格，李涛，刘兆星，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人