【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒的检测，特别是涉及使用bsa模拟病毒的电化学检测方法。
技术介绍
1、电化学免疫传感器中的作用机制通常涉及特定的蛋白质或抗体。在免疫传感器中，病毒的检测通常是通过识别病毒的特定抗原或抗体来实现的。这些抗原或抗体可以与传感器表面的特定受体结合，从而触发电化学信号的变化，这种变化可以被测量并用于定量分析。
2、病毒通常由遗传物质（dna或rna）和蛋白质外壳（称为衣壳）组成。以黄瓜绿斑驳花叶病毒（cgmmv）为例，它的遗传物质是单链rna，而蛋白质则构成病毒的衣壳，保护病毒的rna并帮助病毒进入宿主细胞。黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子为直杆棒状，直径在15nm至18nm之间，长度约为300nm，其核酸为正向单链rna，基因组长度约为6.4kb,cgmmv的基因组包含编码129kda、186kda、29kda和173kda４种蛋白的4个开放阅读框。黄瓜绿斑驳花叶病毒主要侵染西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜等葫芦科作物，在植物病毒检测中需要被重点关注。
3、cn105177187b公开的检测葫芦科种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)的样品制备方法及用途，通过对葫芦科种子进行壳、仁分离处理，保留了种子中含毒量较高的部分，降低了因种仁中存在的高脂肪含量等问题而出现的漏检情况，也为rt-pcr检测、dot-elisa检测提供了高质量的待测样本。
4、在现有技术中一般的电化学免疫传感器由于物理吸附对氧化还原反应探针以及电极电子传递均有影响，不利于电化学免疫传感器对黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原浓度的检测，且用于固
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种使用bsa模拟病毒的电化学检测方法，本专利技术通过使用导电聚合物将具有多孔且表面丰富的氧化石墨烯气凝胶作为电化学检测的界面，有效提升抗体固定的稳定性，生物相容性好，通过电极表面阻抗值变化快速获得抗原浓度，提升检测的灵敏度和精确度。
2、为解决此技术问题，本专利技术的技术方案是：一种使用bsa模拟病毒的电化学检测方法，包括以下步骤：
3、s1、构建电化学免疫检测传感器，所述电化学免疫检测传感器具有粘接在玻碳电极表面的多孔修饰层，所述多孔修饰层包括电化学原位聚合在玻碳电极表面的吡咯和多巴胺，聚合后的聚多巴胺和聚吡咯通过π-π键吸附并包围具有多孔结构的石墨烯气凝胶；
4、在多孔修饰层表面固定有固定剂量的抗体；
5、s2、取s1制得的在多孔修饰层表面固定有抗体的玻碳电极作为工作电极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极组成三电极体系，将三电极体系置于电解液中保持平行，分别在多孔修饰层的表面滴加已知浓度的抗原蛋白质测试交流阻抗值，获得工作电极的电荷转移电阻-抗原浓度线性方程;
6、s3、将含有待检测抗原的溶液滴加在玻碳电极的多孔修饰层，抗原与固定多孔修饰层表面的抗体形成沉淀复合物，阻碍玻碳电极表面电子的传递，获得增强的阻抗值，根据s2所得线性方程计算待检测抗原浓度。
7、优选构建电化学免疫检测传感器的制备方法包括以下步骤：
8、s11、在经过打磨抛光的玻碳电极表面电化学聚合有聚吡咯-聚多巴胺-石墨烯气凝胶多孔修饰层滴加有抗体-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的ph值为7；
9、s12、将经过s11处理的玻碳电极置于37℃培养箱中温育30min,得吸附有抗体的电极；
10、s13、将聚乙二醇滴加在经过s12的多孔修饰层表面固定抗体；
11、s14、在经过s13的多孔修饰层的表面引入系列已知浓度的抗原，分别在37℃下恒温温育35min，在多孔修饰层表面得抗体抗原复合物并获得该抗体抗原复合物电极免疫反应的电荷转移电阻-抗原浓度的标准曲线。
12、本专利技术根据制得的交流阻抗值计算抗原浓度，本专利技术利用氧化石墨烯气凝胶增加了电化学反应界面，当阻抗变化时更容易被阻抗值所反映，检测的灵敏度明显提高。在检测结束后，使用酸性或碱性溶液清洗传感器表面，例如0.1mol/hcl或者是0.1mol/naoh溶液破坏抗原-抗体之间的结合，从而去除结合的抗原，方便所得电化学免疫检测传感器的再次使用或者反复使用。
13、优选石墨烯气凝胶的制备方法包括以下步骤：
14、s111、配制浓度为3 mg ml-1至5 mg ml-1的氧化石墨烯分散液，向氧化石墨烯分散液中分别加入0.7至1.4ml的dmf，保持氧化石墨烯分散液与dmf的体积和为5ml；
15、s112、将s111所得分散体系加入聚乙烯醇搅拌均匀得溶胶体系，将所得溶胶体系置于80℃至100℃下加热去除水分形成水凝胶；
16、s113、然后将水凝胶移置超低温保存箱中于-80℃下冷冻干燥48小时至96小时去除水和dmf形成的冰晶，得具有微孔结构的氧化石墨烯气凝胶。本专利技术中使用氧化石墨烯气凝胶具有微孔结构，聚吡咯-聚多巴胺分别通过石墨烯气凝胶以及石墨烯气凝胶颗粒之间的空隙形成氧化石墨烯气凝胶与玻碳电极表面以及氧化石墨烯气凝胶之间的连接。
17、优选聚吡咯-聚多巴胺-石墨烯气凝胶多孔修饰层的制备方法包括以下步骤：
18、a1、将吡咯和聚多巴胺分散均匀分散于去离水中；调节电解液的ph值为6.2至6.8；通入氮气去除电解液中的氧气；
19、a2、电化学聚合；
20、将经过研磨清洁的表面涂覆并附着有粉碎的石墨烯气凝胶颗粒层的玻碳电极置于a1所得液相中静置，吡咯和多巴胺在氧化石墨烯气凝胶的吸附作用下分布于氧化石墨烯气凝胶表面，进行电化学聚合；
21、在电氧化聚合的过程中具有微孔结构的氧化石墨烯气凝胶作为电子的传递介质拓展了电化学聚合的反应界面，从而形成了聚吡咯-聚多巴胺围绕氧化石墨烯气凝胶并将其粘接在玻碳电极表面。本专利技术将通过分子间作用力附着在玻碳电极表面的氧化石墨烯气凝胶，利用其自身的导电性以及对吡咯和多巴胺吸附作用，在电化学聚合过程中利用聚吡咯和聚多巴胺有效将氧化石墨烯均匀的稳定的固定在玻碳电极表面。
22、优选步骤a2中电化学聚合采用循环伏安法，电压扫描范围为0v至(0.7v～1.4v)，扫速50mv/s或者100mv/s，循环10次。本专利技术中循环伏安法电压扫描范围中的电压是相对甘汞电极。
23、优选所述氧化石墨烯气凝胶与吡咯的质量比为1：（0.5至0.7）；
24、多巴胺与吡咯的质量比为1：（0.2至0.3）。
25、优选将目标量氧化石墨烯气凝胶涂覆干燥后预置在玻碳电极表面，氧化石墨烯气凝胶的用量为3mg至5mg。
26、优选s3中电解液为ph值为7.4的pbs缓冲液以及
27、0.5mmol/lk4[fe(cn)6]/0.5mmol/lk3[fe(cn)6]/0.1mol/lkcl。
28、优选s2中交流阻抗的测试条件如下：
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【技术保护点】
1.一种使用BSA模拟病毒的电化学检测方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于：构建电化学免疫检测传感器的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于：石墨烯气凝胶的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述的电化学检测方法，其特征在于：聚吡咯-聚多巴胺-石墨烯气凝胶多孔修饰层的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的电化学检测方法，其特征在于：步骤A2中电化学聚合采用循环伏安法，电压扫描范围为0V至(0.7V～1.4V)，扫速50mV/s或者100mV/s，循环10次。
6.根据权利要求4所述的电化学检测方法，其特征在于：所述氧化石墨烯气凝胶与吡咯的质量比为1：（0.5至0.7）；
7.根据权利要求4所述的电化学检测方法，其特征在于：将目标量氧化石墨烯气凝胶涂覆干燥后预置在玻碳电极表面，氧化石墨烯气凝胶的用量为3mg至5mg。
8.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于：
9.根据权利要求1所述的电化学检
...【技术特征摘要】
1.一种使用bsa模拟病毒的电化学检测方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于：构建电化学免疫检测传感器的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于：石墨烯气凝胶的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述的电化学检测方法，其特征在于：聚吡咯-聚多巴胺-石墨烯气凝胶多孔修饰层的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的电化学检测方法，其特征在于：步骤a2中电化学聚合采用循环伏安法，电压...
【专利技术属性】
技术研发人员：王佳莹，崔俊霞，吕晓玲，陈先锋，赵雷，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院宁波国检贸易便利化服务中心，
类型：发明
国别省市：
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