【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌种培育，尤其涉及一种松茸子实体分离培育菌种的方法。
技术介绍
1、松茸学名松口蘑，隶属担子菌亚门，口蘑科，是松株等树木外生菌根真菌，是我国二级濒危保护物种。松茸对生长环境要求极为苛刻，生长极为缓慢，一般需5-6年，产量极少，价格昂贵。
2、研究表明，松茸富含松茸多糖、不饱和脂肪酸、核酸衍生物、多种氨基酸及肽类物质。松茸所含松茸多糖的抗肿瘤活性远远高于灵芝，在被研究的15种真菌中松茸抗肿瘤活性居首位。因此，世界各国及各大科研机构正积极地进行野生松茸的人工栽培及菌种分离培育的研究，但至今仍无法突破菌种分离培育技术及人工栽培的难题。
技术实现思路
1、本申请目的之一在于提供了一种松茸子实体分离培育菌种的方法，所述方法包括以下步骤：
2、(1)初级菌种的分离和培育：采集成熟70-80％无虫松茸，在无菌室内无菌条件下用75％酒精消毒松茸子实体，然后用手术刀把松茸纵剖两半，在菌盖菌柄处，切取0.5cm3-0.6cm3菌肉，移放到装有斜面培养基的高20cm直径3cm的试管中，接种后，恒温24-26℃无光培养8-10天至菌丝长满试管，形成初级菌种；
3、(2)一级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将初级菌种以1％接种量接入装有100ml培养基的250ml三角瓶中，恒温24-26℃摇床震荡培养6-9天，成为一级摇瓶菌种；
4、(3)二级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将一级摇瓶菌种以10％接种量接入装有200ml培养基的500ml三角
5、优选地，所述步骤(1)中斜面培养基配方为：葡萄糖2份，硫酸镁0.1份，琼脂2份，酵母膏0.5份。
6、更优选地，所述步骤(2)和(3)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，酵母粉1份，奶粉1份，蛋白胨0.12份，磷酸二氢钾0.15份，硫酸镁0.01份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
7、本专利技术的目的之二在于提供一种松茸菌丝体的培育方法，所述方法包括以下步骤：
8、(1)小罐一级液体发酵：将上述分离培育完成的菌种按1％接种量接入已经放好5％v/v培养基的小罐进行一级发酵，罐压保持30-40kpa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.2-0.4v/v·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时，进行初步扩菌培养；
9、(2)中罐二级液体发酵：将小罐中菌丝体转入已经放入5％v/v培养基的中罐进行二级发酵，罐压保持40-50kpa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.3-0.5v/v·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时；
10、(3)大罐三级液体发酵：将中罐中菌丝体转入已经放入5％v/v培养基的大罐进行三级发酵，罐压保持50-60kpa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.5-0.7v/v·min，保持24-26℃恒温培养120-144小时，至此，松茸菌丝体培育完成。
11、其中，上述表示培养基的加入量的单位％v/v是指培养基的体积与罐的体积比。
12、优选地，所述步骤(1)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆3份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠1份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
13、更优选地，所述步骤(2)中培养基的配方为：蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆2份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠0.1份，硫酸镁0.1份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
14、更优选地，所述步骤(3)中培养基的配方为：蔗糖3份，黄豆粉5份，蛋白胨0.1份，磷酸二氢钾0.3份，硫酸镁0.15份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
15、更优选地，步骤(1)的小罐的体积为50l-150l，优选为80-120l；步骤(2)的中罐的体积为0.5t-1.5t，优选为0.8t-1.2t；步骤(3)的大罐的体积为4t-6t，优选为4.5t-6.5t。
16、本专利技术的目的之三在于提供一种松茸菌丝体粉的制备方法，所述制备方法为：在上述松茸菌丝体的培育方法的步骤(3)后，还包括步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集菌丝体，然后再经烘干工艺，得到松茸菌丝体粉。
17、优选地，所述烘干工艺在70-85℃的温度下进行。
18、本专利技术的目的之四在于提供一种松茸菌丝体浓缩液的制备方法，所述制备方法为：上述松茸菌丝体粉的制备方法中步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集滤液，经浓缩罐浓缩，得到松茸菌丝体浓缩液。
19、上述步骤中使用的培养基的配制如下：
20、按照各个培养基配方中的配比进行称料，然后以各配方中所有原料的总重与水的重量比为1:1加入蒸馏水，进行充分搅拌，再经121℃高温灭菌30分钟，待冷却后即可使用。
21、本专利技术的松茸子实体分离培育菌种的方法通过步骤(1)得到的初级菌种即具有活性，之后的一级摇瓶菌种培育和二级摇瓶菌种培育步骤是对初级菌种的进一步优化和培育。并且，本专利技术采用三级液体发酵技术，通过对罐体积进行筛选并选择发酵条件，可以以高产率得到松茸菌丝体。
22、另外，本专利技术培育得到的松茸菌丝体的松茸多糖的含量可高达20％左右，远远高于野生松茸的8％左右的松茸多糖含量。
23、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
24、本专利技术打破了松茸不可人工分离菌种培育的壁垒，可以在人工培育下大量产出松茸菌丝体粉和松茸菌丝体浓缩液。根据本专利技术的方法得到的原种菌丝体种还可用于松茸栽培，为一年四季产出松茸提供了基础菌种保障。
25、另外，本专利技术培育得到的松茸菌丝体的松茸多糖含量高，具有更高的营养和药用价值。
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1.一种松茸子实体分离培育菌种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中斜面培养基配方为：葡萄糖2份，硫酸镁0.1份，琼脂2份，酵母膏0.5份。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，酵母粉1份，奶粉1份，蛋白胨0.12份，磷酸二氢钾0.15份，硫酸镁0.01份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
4.一种松茸菌丝体的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆3份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠1份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基的配方为：蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆2份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠0.1份，硫酸镁0.1份，维生素B10.005份，维生素B20.005
7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养基的配方为：蔗糖3份，黄豆粉5份，蛋白胨0.1份，磷酸二氢钾0.3份，硫酸镁0.15份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
8.一种松茸菌丝体粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：在权利要求4-7中任一项所述的松茸菌丝体的培育方法的步骤(3)后，还包括步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集菌丝体，然后再经烘干工艺，得到松茸菌丝体粉。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述烘干工艺在70-85℃的温度下进行。
10.一种松茸菌丝体浓缩液的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：权利要求8或权利要求9步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集滤液，经浓缩罐浓缩，得到松茸菌丝体浓缩液。
...【技术特征摘要】
1.一种松茸子实体分离培育菌种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中斜面培养基配方为：葡萄糖2份，硫酸镁0.1份，琼脂2份，酵母膏0.5份。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，酵母粉1份，奶粉1份，蛋白胨0.12份，磷酸二氢钾0.15份，硫酸镁0.01份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
4.一种松茸菌丝体的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆3份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠1份，维生素b10.005份，维生素b20.005份。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基的配方为：蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆...
【专利技术属性】
技术研发人员：金一权，任勇虎，
申请(专利权)人：延边圣泽方圆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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