【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对、试剂盒和方法。
技术介绍
1、乌原鲤(procypris merus lin)，又名乌鲤、乌钩、墨鲤等，是我国特有的地方种，在分类上隶属于鲤形目(cypriniformes)，鲤科(cyprinidae)，鲤亚科(cyprininae)，原鲤属(procypris)，是鲤亚科最原始的鱼类之一。乌原鲤曾分布于西江上游的干流和支流，但近二十年以来，乌原鲤野外资源量日益枯竭，在传统水域已极难捕获，被列为《中国濒危动物红皮书》濒危物种和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》易危物种，2021年被列为国家二级保护动物，乌原鲤保护工作迫在眉睫，亟需探明乌原鲤的分布区域。
2、传统的资源调查工作主要是以设网、设笼以及访问调查为主，耗时费力且效率低下，不利于短时间内开展大规模的种质资源监测工作。近年来，环境dna技术不断发展和应用，以成为动物野外调查的重要技术，但缺乏相应的特异性引物仍是限制乌原鲤种质资源监测的重要瓶颈。
3、鉴于此，本专利技术提供一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对、试剂盒和方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对、试剂盒和方法。目的是通过设计的特异性引物对监测乌原鲤分布的环境dna，解决了传统调查方法费时费力且效率低下的问题，适合规模化推广应用。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、第一方面
4、本专利技术基于乌原鲤基因序列，设计了用于环境dna检测乌原鲤存在的特异性引物对：f：tgagcttgccctagtagctt(seq id no：1)，r：ggggtggcttaccccaga(seq id no：2)。
5、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
6、进一步，所述的引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述的引物对的反向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
7、第二方面提供一种监测乌原鲤分布的环境dna的试剂盒，所述的试剂盒包括所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对。
8、第三方面提供一种监测乌原鲤分布的环境dna的方法，包括如下的步骤：
9、(1)提取待测样品环境dna；
10、(2)以待测样品环境dna为模板，采用所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对进行pcr扩增；
11、(3)根据电泳结果是否发生特异性的pcr扩增，来判断待测样品中是否存在乌原鲤。
12、进一步，若电泳结果中出现162bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在乌原鲤；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在乌原鲤。
13、进一步，步骤(3)中pcr反应体系为：es taq master mix(dye)12.5μl，ddh2o 9μl，dna模板1.5μl，正向引物1μl，反向引物1μl。正向引物和反向引物的浓度为10pmol/μl。
14、进一步，步骤(3)中pcr反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
15、进一步，步骤(1)中采用magen hipure water dnakit试剂盒提取待测样品环境dna。
16、进一步，在步骤(1)之前还包括采集环境水样：在待测样品的河流断面的左、中和右处，用容量为3-7l的采水器采集位于表层1m以上水样至少5l；进行抽滤，得到待提取的待测样品环境dna。
17、进一步，所述抽滤时采用孔径为0.45μm的滤膜。
18、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
19、(1)本专利技术利用乌原鲤残留水体中的粪便、皮肤脱落物及尸体等遗迹提取环境dna样品，结合分子生物学技术，开发出具有特异性且扩增效率高的pcr引物对，建立了可针对乌原鲤的快速、准确的检测鉴定方法；
20、(2)本专利技术采用的引物对是针对乌原鲤基因序列设计出的特异性引物，特异性强，结果可靠。
21、(3)本专利技术仅需要取水样，过滤取滤渣，即可提取出可用的环境dna样品，敏感度高。
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1.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
2.根据权利要求1所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对，其特征在于，所述的引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1或2所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对。
4.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，包括如下的步骤：
5.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，若电泳结果中出现162bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在乌原鲤；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在乌原鲤。
6.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应体系为：Es Taq Master Mix(Dye)12.5μL，ddH2O9μL，DNA模板1.5μL
7.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
8.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中采用Magen HiPure Water DNA Kit试剂盒提取待测样品环境DNA。
9.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括采集环境水样：在待测样品的河流断面的左、中和右处，用采水器采集位于表层1m以上水样至少5L；进行抽滤，得到待提取的待测样品环境DNA。
10.根据权利要求9所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，所述抽滤时采用孔径为0.45μm的滤膜。
...【技术特征摘要】
1.一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列如seq id no：1-2所示。
2.根据权利要求1所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对，其特征在于，所述的引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述的引物对的反向引物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.一种监测乌原鲤分布的环境dna的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1或2所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对。
4.一种监测乌原鲤分布的环境dna的方法，其特征在于，包括如下的步骤：
5.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的方法，其特征在于，若电泳结果中出现162bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在乌原鲤；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在乌原鲤。
6.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境dna的方法，其特征在于，步骤(3)中pcr反应体系为：es taq master ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李育森，李哲，吴伟军，林勇，王晓清，王大鹏，黄博，雷建军，施军，韩耀全，杨泽英，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产科学研究院广西壮族自治区渔业病害防治环境监测和质量检验中心，广西壮族自治区水生野生动物救护中心，
类型：发明
国别省市：
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