【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于新型电化学发光功能材料的电化学发光生物传感器的制备方法，以及其在毒蘑菇检测中的应用。属于新型纳米功能材料与化学生物传感器。
技术介绍
1、毒蕈，亦称毒菌，俗称“毒蘑菇”。
2、常见的毒蕈毒素有毒肽、毒伞素、毒蝇碱等。其中，尤以毒肽为主，毒肽的毒性机理都是能够损坏细胞核圈，抑制细胞核 rna 多聚酶，阻止 dna 向 rna转录，从而阻断蛋白质的合成。毒肽主要包括鹅膏毒肽、鬼笔毒肽等。因此，快速、准确检测鹅膏毒肽，从而鉴别毒蘑菇及相关食品对于食品安全和人们的生命健康具有重要意义。
3、目前，对毒蕈毒素的分析检测方法，除形态特征识别法、动物试验检验法、真菌分类学鉴定法外，采用化学方法检测毒蘑菇应用的较为广泛，而人们对毒蘑菇的分类识别也正由个体水平向分子水平迈进。液汁显色法应用得比较早，它是将浓盐酸滴在干枯的菌盖、菌柄上，看是否会出现蓝色反应。此方法需要试剂少，操作简单，但通常在毒性较强的毒蘑菇中可应用。层析法分为纸层析法、薄层层析法，采用肉桂醛甲醇溶液，浓盐酸蒸汽发生显色反应，可分离鬼笔毒肽、鹅膏毒肽等；薄层层析法具有更高的灵敏度，操作比较简单，能够分离监测大多数毒蘑菇，但是，成本比较高。高效液相色谱法在检测中毒者尿液或血浆中的肽类毒素比较常用。该方法具有突出的优势，但对实验条件具有较高的要求。傅里叶变换近红外光谱法能够避免对真菌样品的破坏，具有较多的优势，不过也仅限于在实验室进行。
4、电化学发光（electrochemiluminescence，ecl）是一种通过将适当的
5、尽管电化学发光传感技术具有设备简单、灵敏度高以及可便携式、即时检测的优势，但是包括电化学发光传感技术在内的无论何种检测技术，在简化样品预处理步骤和检测操作程序以及减少检测时间上，都是需要不断攻克的技术难点，也是使得能够检测技术得到更广泛市场推广所不得不解决的关键问题。同时，利用电化学发光传感检测技术，对毒蕈毒素进行快速、灵敏、批量检测的研究和产品还未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种操作方便、检测快速、灵敏度高、重现性好的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，所制备的电化学发光生物传感器，准确性高单、重现性好、稳定性强，可用于对毒蘑菇中鹅膏毒肽的快速、灵敏检测，进而实现对对毒蘑菇的鉴定鉴别。基于此目的，本专利技术首先以incl3和三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化钌[ru(dcbpy)3]cl2作为前驱体，通过自组装的方式制备出了具有3d结构和自发光性质的钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs。其次，以四氯化铪hfcl4作为金属离子铪前驱体、硼酸h3bo3和四[4-(4'-羧基苯基)苯基]乙烯tcbpe共同作为配体并通过溶剂热一锅法制备得到双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs。然后，通过基因筛选和编辑等方法得到可用于对鹅膏毒肽特异性识别的捕获适配体dna-1以及可与dna-1互补配对的互补适配体dna-2。最后，通过化学键和和层层修饰的方式制备得到可用于检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器。
2、本专利技术采用的具体技术方案如下：
3、1. 本专利技术所制备的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器，其特征在于所述的免洗电化学发光生物传感器由一次性可抛电极、钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs、捕获适配体dna-1、双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs标记的互补适配体dna-2构成；所述的钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs是以incl3和三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化钌[ru(dcbpy)3]cl2作为前驱体并通过自组装的方式制备得到的；所述的捕获适配体dna-1为碱基序列5’-nh2-c atg ctt ccc cag gga gat gga ggt cttttt ggt tgt tgg tgg ggg aat ctt ttg gta ttg agg aac atg-3’，该序列会对鹅膏毒肽进行特异性识别并捕获。
4、2. 如技术方案1所述的钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs的制备步骤为：
5、将10~20 mg [ru(dcbpy)3]cl2和10~30 mg incl3加入到50 ml由去离子水和n,n-二甲基甲酰胺dmf组成的混合溶剂中，超声、搅拌处理至[ru(dcbpy)3]cl2和incl3全部溶解；然后继续加入盐酸溶液0.5~1.5 ml，搅拌均匀后倒入100 ml的高压反应釜中，在80~120 ℃的环境中加热8~12 h；冷却至室温后，离心收集橙红色固体，并用dmf和甲醇交替洗涤；最后常温真空干燥，得到ruin-mofs，如图1所示，为最优条件下制备得到的ruin-mofs的表征图；
6、所述的去离子水和n,n-二甲基甲酰胺dmf组成的混合溶剂中去离子水和n,n-二甲基甲酰胺dmf的体积比为1:2~3；
7、所述的盐酸溶液浓度为0.1 m。
8、3. 如技术方案1-2所述的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器，其特征在于所述的双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs标记的互补适配体dna-2，是由双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs对互补适配体dna-2进行标记得到的；
9、所述的互补适配体dna-2碱基数量为23~45个；
10、所述的互补适配体dna-2会与捕获适配体dna-1发生特异性碱基互补结合。
11、4. 如技术方案1-3所述的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器，其特征在于所述的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备步骤为：
12、（1）以一次性可抛电极为工作电极，在电极表面滴涂8~12 µl的ruin-mofs溶胶，室温下晾干；
13、（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液pbs清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µl浓度为10 nm的捕获适配体dna-1溶液，4 ℃ 下保存晾干；
14、（3）将步骤（2）中得到的电极用pbs清洗，继续在电极表面滴涂6~12 µl 乙二胺溶液mea封闭非特异性活性位点，4 ℃ 下晾干，然后用pbs清洗，并在4 ℃ 下保存晾干，得到修饰好的基底电极；
15、（4）双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs是以四氯化铪hfcl4作为金属离子铪前驱体、硼酸h3bo3和四[4-(4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的免洗电化学发光生物传感器由一次性可抛电极、钌/铟基立方块金属有机骨架材料RuIn-MOFs、捕获适配体DNA-1、双配体铪基金属有机骨架花状材料Hf-MOFs标记的互补适配体DNA-2构成；所述的钌/铟基立方块金属有机骨架材料RuIn-MOFs是以InCl3和三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化钌[Ru(dcbpy)3]Cl2作为前驱体并通过自组装的方式制备得到的；所述的捕获适配体DNA-1为碱基序列5’-NH2-C ATG CTT CCC CAG GGA GAT GGA GGT CTTTTT GGT TGT TGG TGG GGG AAT CTT TTG GTA TTG AGG AAC ATG-3’，该序列会对毒伞肽α-amanitin进行特异性识别并捕获。
2.如权利要求1所述的一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的钌/铟基立方块金属有机骨架材料RuIn-MOFs的制备步骤为：
3.如权利要求1-2所述的一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传
4.如权利要求1-3所述的一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备步骤为：
5.如权利要求1-4所述的一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的一次性可抛电极选自下列导电基底中的一种：ITO导电玻璃、FTO导电玻璃、丝网印刷电极、导电碳布、铁片、镍片、铜片、钛片、硅片、镍网、钛网、纸基电极。
6.采用如权利要求1-5所述的制备方法所制备的检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器，其特征在于应用于毒蘑菇中鹅膏毒肽的检测，所述的检测步骤为：
...【技术特征摘要】
1. 一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的免洗电化学发光生物传感器由一次性可抛电极、钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs、捕获适配体dna-1、双配体铪基金属有机骨架花状材料hf-mofs标记的互补适配体dna-2构成；所述的钌/铟基立方块金属有机骨架材料ruin-mofs是以incl3和三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化钌[ru(dcbpy)3]cl2作为前驱体并通过自组装的方式制备得到的；所述的捕获适配体dna-1为碱基序列5’-nh2-c atg ctt ccc cag gga gat gga ggt cttttt ggt tgt tgg tgg ggg aat ctt ttg gta ttg agg aac atg-3’，该序列会对毒伞肽α-amanitin进行特异性识别并捕获。
2.如权利要求1所述的一种检测毒蘑菇的免洗电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于所述的钌/铟基立方块金属有机...
【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，徐锐，王华斌，向泰，田林，刘莹，李晨晨，梁瑞珂，杨京辉，吴周瑞，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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