检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法技术

本发明专利技术公开了２组引物，还公开了利用２组引物检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的方法，包括以下步骤：提取待测灰霉病菌群体的ＤＮＡ；以该ＤＮＡ为模板，利用第一组引物和第二组引物分别进行实时定量ＰＣＲ扩增并记录其达到荧光阈值的循环数；参照实时定量ＰＣＲ测定待测灰霉病菌群体的ＤＮＡ总量的标准曲线以及实时定量ＰＣＲ测定抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的灰霉病菌的ＤＮＡ量的标准曲线，得到待测灰霉病菌群体的ＤＮＡ总量Ｑ以及抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的灰霉病菌的ＤＮＡ量ＱＲ；计算待测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性频率。本发明专利技术引物特异性高，能准确、快速、便捷地检测到田间灰霉病菌群体的抗性频率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种PCR法检测灰霉病菌群体对甲氧基丙 烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法。
技术介绍
灰霉病是由半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、葡萄孢属病原菌(Botrytis)侵染引起 的。该病原菌是一种寄主非常广泛的兼性寄生真菌，它可寄生于多种水果、蔬菜和花卉中， 主要危害花序、幼果和将要成熟的果实，也可侵染果梗、新梢与幼嫩叶片，该病菌已成为储 藏、运输、销售期间引起果实腐烂的主要病害。 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(如嘧菌酯、醚菌酯等)可以比较有效的防治灰霉病， 该类化合物是以天然产物Strobilurin为先导合成的新型杀菌剂，它们主要是通过抑制病 菌的呼吸作用来破坏病菌的能量合成从而达到杀菌效果。阿米西达具有较广的杀菌谱， 可以预防和治疗多种农作物病害，而且能够改善作物产量和品质，并且其毒性仅为食盐的 50%，在国外已经广泛用于高价值蔬菜或水果的病害防治。 在国外，由于该药剂长期大量使用，已经有十多种病菌对该药剂产生了明显的抗 性问题。近来，多株抗嘧菌酯(商品名为阿米西达)的灰霉病菌也在我国田间分离得到， 研究该病菌对嘧菌酯抗性机制发现，Cytb基因的第143位氨基酸突变导致了灰霉病菌对嘧 菌酯产生抗性。由于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂之间存在交互抗性，病菌对一种药剂产生抗 性后，对该类药剂的其它品种也会产生抗性。 近年来随着分子生物学技术(特别是实时定量PCR)的不断发展，在明确病菌抗药 性分子机制的基础上，利用分子检测技术可从大量的病菌群体中检测出频率很低(0. 1% ) 的抗药个体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于检测灰霉病菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列，该引物特异性高，能快速检测灰霉病菌对甲氧基丙烯酸酯类抗性频率。 —种用于检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列，包括两组引物第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ IDN0 :1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID N0:2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID N0:3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO :4所述的碱基序列。 本专利技术还提供了一种利用上述引物序列检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类 杀菌剂抗性频率的方法，包括以下步骤 (1)提取待测灰霉病菌群体的DNA ; (2)以步骤(1)得到的DNA为模板，利用第一组引物和第二组引物分别进行实时定量PCR扩增并记录其达到荧光阈值的循环数； (3)根据步骤(2)得到的循环数，参照实时定量PCR测定待测灰霉病菌群体的DNA 总量的标准曲线以及实时定量PCR测定抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的灰霉病菌的DNA量的 标准曲线，得到待测灰霉病菌群体的DNA总量Q以及待测灰霉病菌群体中抗甲氧基丙烯酸 酯类杀菌剂的灰霉病菌的DNA量QK ; (4)计算得到待测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性频率FR = QK/ Q。 本专利技术根据灰霉病菌抗药性的分子机制，设计了两组高特异性的引物用来高通量检测抗性频率，在病害发生初期，就能准确、快速、便捷地检测到田间灰霉病菌群体的抗性 频率，对指导灰霉病的抗性治理提供技术支持。附图说明 图1为本专利技术第二组引物在Cytb上的位置序列； 图2为本专利技术引物序列在Cytb的序列上的位置图谱； 图3为本专利技术两组引物的特异性检测的凝胶电泳图； 图4为待测灰霉病菌群体的DNA实时定量PCR扩增标准曲线； 图5为抗性灰霉病菌的DNA实时定量PCR扩增标准曲线。具体实施方式 引物合成 通过NBCI查找灰霉病菌Cytb基因全序列，再通过GenScan分析该序列得出，灰霉 病菌Cytb序列含有3个内含子。因为Cytb编码区比较保守，而该基因内含子序列在不同 病原真菌中会有较大的变异性，因此，根据内含子序列设计灰霉病菌特异的PCR引物。 本专利技术中的第一组引物Bc-Fl和Bc-R2就定位在灰霉病菌Cytb序列的第2个内 含子中，利用该对种特异性引物，通过实时定量PCR就可检测出DNA样品中灰霉病菌的DNA 总量(包括敏感和抗性病菌)。 Cytb基因第143位密码子GGT突变成GCT导致灰霉病菌对甲氧基丙烯酸酯产生抗 性，根据该点突变设计了正向PCR引物Bcl43-F，该引物3'末端碱基C能够和对甲氧基丙烯 酸酯具有抗性的灰霉病菌菌株(以下简称抗性菌株)DNA配对，无法和对甲氧基丙烯酸酯敏 感的灰霉病菌菌株(以下简称敏感菌株)的DNA配对；反向引物Bcl43-R序列是对灰霉病 菌特异的序列，位于第3个内含子中。 因此，利用该组等位专化PCR引物，能从抗性菌株的DNA中扩增出条带，不能从敏 感菌株或其它菌株的DNA中扩增出任何条带(引物在所在的序列如图1所示)。 上述引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表所示 <table>table see original document page 5</column></row><table> 上述引物在Cytb序列上的物理位置如图2所示，包括上述序列的引物由上海博彩 合成。 DNA提取 选用菌株小麦赤毒病菌(Fusarium graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、褐腐病菌(Monilinia fructicola)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、禾舀 瘟病菌(Magnaporthe grisea)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、对嘧菌酯抗性的灰霉病菌 (Bcl43-1， Bcl43-2， Bcl43-3)、对嘧菌酯敏感的灰霉病菌(Bc-S-1， Bc-S-2， Bc-S-3)。 上述菌株为实验材料，通过随机分离纯化得到，菌株的特性对实验结果没有影响， 提取DNA前均培养在PDA平板上，DNA提取过程如下 从PDA平板上刮取菌丝约lOOmg，置于l. 5-mL E卯endorf管中，加500 y L DNA提取 裂解液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，20mM NaCl， 1 % SDS)，用电钻充分研磨，振荡混匀，室 温静止10min ;13200r/min 4。C，离心5min ;取上清液约400 ii L于新的1. 5_mL Eppendorf 管中，加750 ii L无水乙醇，混和混匀，13200r/min 4°C ，离心5min，弃上清；沉淀用70%乙醇 洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30 ii L TE (pH 8. 0) ， -2(TC保存备用。 引物特异性验证 以上述菌株的DNA为模板，分别对种特异性引物Bc-Fl+Bc-R2和等位专化PCR引 物Bcl43-F+Bcl43-R进行特异性测定，每个反应均有一个阴性对照(以无菌水作为模板)。 PCR反应的体系为1 ii L DNA模板(约0. 4ng)，引物各0. 2 y mol 1—1， dNTP 0.2iimo1 1—1， MgC122mmo1 1—1， 1 X缓冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶1. 5U个单位，双 蒸水补足至25iiL。 反应条件为95。C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列，其特征在于，包括两组引物：第一组引物的正向引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所述的碱基序列。

【技术特征摘要】
一种用于检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列，其特征在于，包括两组引物第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQID NO4所述的碱基序列。2. —种利用权利要求1所述的引物序列检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的方法，包括以下步骤(1) 提取待测灰霉病菌群体的DNA ;(2) 以步骤(1)得到的DNA为...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋金花，吴剑丙，马忠华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]