【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及重排元件及其应用。
技术介绍
1、在酵母中多拷贝表达目的基因是增加目的基因表达量的重要方式。最常用的是用质粒进行表达，但质粒的拷贝数并不稳定，而且需要一定的筛选压力来维持质粒的存活，因此经常不适用于工业生产。在基因组整合目的基因是最稳定表达目的基因的方式，整合在基因组上的目的基因发生丢失的概率极低，通过多次整合同一个基因，可增加其拷贝数，从而增加表达量。但多次整合需要消耗大量的时间和经历，构建菌株的周期较长。为了解决在酿酒酵母基因组上多拷贝整合的问题，前人做了大量的尝试，如通过δ位点整合、rdna位点整合可以获得整合了较多目的基因的菌株，在辅助以crispr技术，低表达筛选标记，提高了多拷贝整合的效果。此外通过scramble技术或位点特异性重组酶，通过重排，也可以实现多个外源目的基因的不同拷贝的组合表达，并能够筛选到使目的基因进行倍增的菌株。
2、但是，现有多拷贝整合的技术往往需要大量的筛选作为基础，且每次使用这些技术的时候，其效果缺乏控制手段。如使用δ位点整合时，大量的克隆都只整合了1-2个拷贝，即便使用crispr技术辅助，也需要筛选几百、几千个克隆才能找到10个拷贝以上的克隆。虽然使用低表达筛选标记可以找到更高拷贝数的克隆，但也引入了不需要的筛选基因。scramble技术则依赖于特有的底盘，且会有较大概率删除基因组上原有的基因，这些基因的删除往往会对酵母的大规模高密度发酵有影响，且对于已经筛选出的高拷贝菌株，再进行scramble会有很高概率丢失原有的多拷贝基因，而极低的概率获得更
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了重排元件及其应用。
2、本专利技术提供了重排元件及其应用。本专利技术通过对已整入基因组的单份外源基因进行基因重排，来实现目的基因的多拷贝整合。通过独特设计的底盘宿主和重排元件，以及独特的柔性crispr体系，使得目的基因的拷贝数得以精确控制，通过迭代重排可不断增加目的基因的拷贝数，而目的基因不会因为重排而丢失或降低拷贝数。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供了重排元件，包括重排元件1和/或重排元件2：
5、所述重排元件1包括：两个对向的frt位点、红色荧光蛋白表达元件和水印标签；
6、所述红色荧光蛋白表达元件包括：tdh3启动子、rfp和adh1终止子；
7、所述重排元件2包括：两个对向的frt位点和水印标签；
8、所述水印标签包括水印序列1、水印序列2和/或水印序列3；
9、所述水印序列1、水印序列2和水印序列3依次具有：
10、(1)、如seq id no.2、3和4所示的核苷酸序列；或
11、(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
12、(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
13、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重排元件1包括：两个对向的frt位点、所述红色荧光蛋白表达元件、所述水印序列1和所述水印序列2；
14、所述重排元件2包括：两个对向的frt位点、所述水印序列1、所述水印序列2和所述水印序列3。
15、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重排元件1依次包括所述水印序列1、frt位点、tdh3启动子、rfp、adh1终止子、frt位点和所述水印序列2；
16、所述重排元件2依次包括所述水印序列1、frt位点、所述水印序列3、frt位点和所述水印序列2。
17、在本专利技术的一些具体实施方案中，
18、(4)、所述frt位点具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；或
19、(5)、所述tdh3启动子具有如seq id no.5所示的核苷酸序列；或
20、(6)、所述rfp具有如seq id no.6所示的核苷酸序列；或
21、(7)、所述adh1终止子具有如seq id no.7所示的核苷酸序列；或
22、(8)、与(4)～(7)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)～(7)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
23、(9)、与(4)～(8)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
24、在本专利技术的一些具体实施方案中，
25、(10)、所述重排元件1具有如seq id no.8所示的核苷酸序列；或
26、(11)、与(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
27、(12)、与(10)或(11)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
28、本专利技术还提供了表达盒，包括所述重排元件和目的基因。
29、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达盒包括所述重排元件2和目的基因。
30、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达盒包括所述水印序列1、frt位点、所述水印序列3、目的基因、frt位点和所述水印序列2。
31、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述目的基因为g418基因。
32、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达盒具有：
33、(13)、如seq id no.37所示的核苷酸序列；或
34、(14)、与(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
35、(15)、与(13)或(14)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
36、在上述研究的基础上，本专利技术还提供了质粒，包括如下任意项以及可接受的载体：
37、(a)、所述重排元件；和/或
38、(b)、所述表达盒。
39、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述可接受的载体包括puc57-kan载体。
40、本专利技术还提供了质粒组合，包括所述质粒和工具质粒；
41、所述工具质粒包括编码重组酶的flp基因、cas9表达盒和grna表达盒。
42、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述工具质粒包括yyece061和/或yyece062；
43、所述yyece061具有：
44、1)、如seq id no.28所示的核苷酸序列；或
45、2)、与1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
46、3)、与1)或2)所述核苷酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重排元件，其特征在于，包括重排元件1和/或重排元件2：
2.如权利要求1所述的重排元件，其特征在于，所述重排元件1包括：两个对向的FRT位点、所述红色荧光蛋白表达元件、所述水印序列1和所述水印序列2；
3.如权利要求1或2所述的重排元件，其特征在于，
4.表达盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的重排元件和目的基因。
5.质粒，其特征在于，包括如下任意项以及可接受的载体：
6.质粒组合，其特征在于，包括如权利要求5所述的质粒和工具质粒；
7.如权利要求6所述的质粒组合，其特征在于，所述工具质粒包括yyEcE061和/或yyEcE062；
8.如下任意项在构建多拷贝整合目的基因和/或适用高密度发酵的宿主中的应用：
9.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
10.如权利要求9所述的宿主，其特征在于，所述宿主包括菌株yyScE034、菌株yyScE051、菌株yyScE058、菌株yyScE080、菌株yyScE085、菌株yyScE089、菌株yyScE094、菌株
11.如下任意项在多拷贝整合基因和/或高密度发酵中的应用：
12.倍增基因的方法，其特征在于，基于如下任意项倍增基因：
...【技术特征摘要】
1.重排元件，其特征在于，包括重排元件1和/或重排元件2：
2.如权利要求1所述的重排元件，其特征在于，所述重排元件1包括：两个对向的frt位点、所述红色荧光蛋白表达元件、所述水印序列1和所述水印序列2；
3.如权利要求1或2所述的重排元件，其特征在于，
4.表达盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的重排元件和目的基因。
5.质粒，其特征在于，包括如下任意项以及可接受的载体：
6.质粒组合，其特征在于，包括如权利要求5所述的质粒和工具质粒；
7.如权利要求6所述的质粒组合，其特征在于，所述工具质粒包括yyece061和/或yyece062；
8.如下任意项在构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾薄轩，刘慧敏，张骊，
申请(专利权)人：元一天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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