一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用。该酵母工程菌株过表达MVA通路相关基因和/或虾青素合成相关基因、下调ERG9基因，和/或敲除半乳糖相关基因。实验表明，本发明专利技术提供的酵母工程菌能够高产虾青素，摇瓶水平达到82mg/L，2L发酵罐达到708mg/L，明显高于目前报道的其他酿酒酵母产虾青素的水平。他酿酒酵母产虾青素的水平。

【技术实现步骤摘要】
一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]虾青素(Astaxanthin,3,3
’‑
dihydroxy
‑
β,β
’‑
carotene
‑
4,4
’‑
dione)是广泛存在于自然界和海洋环境中的天然类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，素有“类胡萝卜素之王”的称誉。虾青素具有很高的抗氧化性，有效的抑制自由基引起的脂质过氧化作用，同时，有抑制肿瘤发生，增强免疫力，清除体内自由基等多方面的生理作用，对紫外线引起的皮肤癌有很好的治疗效果，对糖尿病引起的眼病也有防治作用，在保健品、医药、化妆品、食品添加剂以及水产养殖等方面具有广阔的应用前景。
[0003]虾青素的来源主要有化学合成、来自甲壳纲动物及其加工后的废物、藻类和法夫酵母等。化学合成的虾青素和天然虾青素构型不同，其抗氧化能力仅为天然虾青素的1/3，另外人们还担心合成虾青素的不同立体异构体和一些潜在的合成中间体的安全性。甲壳纲动物及其加工后的废物虾青素含量低且变化大，废弃物本身易腐败不利于运输和加工，而且几丁质、灰分、湿度含量高，由此造成的经济成本较高无法广泛用于商业化生产。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)是目前工业上生产虾青素的重要菌种，然而雨生红球藻生产虾青素受到众多环境因素的影响，比如光照强度、温度、pH、盐浓度、营养物质和各种植物激素及其衍生物。法夫酵母虽然可在发酵罐中快速代谢、高密度生产，但是其虾青素含量低、培养温度低(21℃)等限制了其大规模产业化的应用。鉴于化学合成虾青素抗氧化能力不高，且存在安全性问题，自然提取又面临低效、高成本的问题，人们将目光转向了生物合成。生物合成不仅可以获得高抗氧化性的虾青素，还具有易培养、周期短、环境污染小等优势。
[0004]考虑到通过从天然生产者如雨生红球藻中提取虾青素的生产能力有限和化学合成的生物安全问题，通过代谢工程微生物生产虾青素成为一个有吸引力的替代品。如利用大肠杆菌为宿主，通过基因工程手段导入细菌和藻类的虾青素合成相关基因，可以使大肠杆菌合成虾青素，通过补料发酵可积累虾青素含量320mg/L；再通过提高关键酶的活性可进一步提高虾青素产量最高至880
‑
1130mg/L。以解脂酵母为宿主同样可以合成虾青素，利用不同的细胞器信号肽，改变关键酶在细胞内的定位，提高酶与底物在不同细胞器的接触概率，可提高虾青素的合成效率，通过补料发酵可使得虾青素产量达到858mg/L。在酿酒酵母中，通过表达红发夫酵母或霉菌来源的合成胡萝卜素的相关基因及藻类或细菌源转化胡萝卜素合成虾青素的基因，来使酿酒酵母合成虾青素，通过等离子诱变、构建低温诱导的表达体系，在补料发酵中可合成223
‑
467mg/L的虾青素。
[0005]虾青素的合成始于IPP(异戊二烯焦磷酸)和FPP(法尼烯基焦磷酸),这两种物质在酿酒酵母中可通过内源的MVA路径合成。IPP和FPP可通过CrtE(GGPP合酶)合成GGPP，GGPP通过CrtB(八氢番茄红素合成酶)合成八氢番茄红素，再经CrtI(八氢番茄红素脱氢酶)合成番
茄红素；番茄红素经CrtY(β
‑
胡萝卜素合酶)反应生成β
‑
胡萝卜素，在部分生物中如红发夫酵母，其CrtY与CrtB是合并为一个酶CrtYB，即表达CrtYB,CrtI,CrtE即可合成β
‑
胡萝卜素；β
‑
胡萝卜素经CrtZ(β
‑
胡萝卜素羟化酶)和CrtW(β
‑
胡萝卜素酮基化酶)合成虾青素。
[0006]目前，酿酒酵母工程菌虾青素的产量仅能到达460mg/L；使用大肠杆菌或解脂酵母作为宿主虽然可以达到更高的产量(>700mg/L)，但只有酿酒酵母可以直接用于饲料添加剂，或化妆品添加剂，而其他的均无法直接应用到这些领域，除非对虾青素进行额外的提取纯化才能使用。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种生产虾青素的酵母工程菌株及其构建方法、应用。该菌株高产虾青素，2L发酵罐可达到708mg/L。
[0008]本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了如a)～d)中任意一项或两项以上在生产虾青素中的应用；
[0010]a)过表达MVA通路相关基因；
[0011]b)过表达虾青素合成相关基因；
[0012]c)下调ERG9基因；
[0013]d)敲除半乳糖相关基因；
[0014]所述MVA通路相关基因包括tHMG1、ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20中的至少一种；
[0015]所述虾青素合成相关基因包括CrtE、CrtYB、CrtI、CrtZ和CrtW中的至少一种；
[0016]所述半乳糖相关基因包括GAL1、GAL7、GAL10中的至少一种。
[0017]本专利技术中，MVA通路相关的内源基因除tHMG1基因外，其余内源基因均为全长，所述tHMG1基因编码的蛋白为野生型HMG1蛋白全长(GenBank:CAA86503.1)缺失前529aa(第530
‑
1054位氨基酸)的突变体，突变体长度为525aa。
[0018]所述虾青素合成相关的外源基因编码的酶的genebank登录号如下：
[0019]CrtE：AIP94028.1；CrtYB:Q7Z859.1；CrtI:CED83513.1；CrtW：ADN43075.1；CrtZ：AKQ20654.1。所述外源基因依照酿酒酵母进行密码子优化，优化后的CrtE基因序列为SEQ ID NO:1(1131bp)，优化后的CrtYB基因序列为SEQ ID NO:2(2022bp)，优化后的CrtI基因序列为SEQ ID NO:3(1749bp)，优化后的CrtW基因序列为SEQ ID NO:4(963bp)，优化后的CrtZ基因序列为SEQ ID NO:5(882bp)。
[0020]一些实施方案中，所述ERG20和CrtE基因融合过表达。
[0021]本专利技术中，所述下调ERG9基因为敲除ERG9基因的启动子或将ERG9基因的启动子更换为较原启动子启动强度较弱的启动子。
[0022]本专利技术还提供了重组酵母菌株，其过表达MVA通路相关基因和/或
[0023]虾青素合成相关基因，和/或下调ERG9基因；
[0024]所述MVA通路相关基因包括tHMG1、ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20中的至少一种；
[0025]所述虾青素合成相关基因包括Cr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.如a)～d)中任意一项或两项以上在生产虾青素中的应用；a)过表达MVA通路相关基因；b)过表达虾青素合成相关基因；c)下调ERG9基因；d)敲除半乳糖相关基因；所述MVA通路相关基因包括tHMG1、ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20中的至少一种；所述虾青素合成相关基因包括CrtE、CrtYB、CrtI、CrtZ和CrtW中的至少一种；所述半乳糖相关基因包括GAL1、GAL7、GAL10中的至少一种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ERG20和CrtE基因融合过表达；所述下调ERG9基因为敲除ERG9基因的启动子或将ERG9基因的启动子更换为较原启动子启动强度较弱的启动子。3.重组酵母菌株，其特征在于，其过表达MVA通路相关基因和/或虾青素合成相关基因，和/或下调ERG9基因；所述MVA通路相关基因包括tHMG1、ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20中的至少一种；所述虾青素合成相关基因包括CrtE、CrtYB、CrtI、CrtZ和CrtW中的至少一种；所述过表达的基因由P
GAL1
、P
GAL7
或P
GAL10
启动子调控。4.根据权利要求3所述的重组酵母菌株，其特征在于，其以酿酒酵母为底盘菌，且半乳糖相关基因被敲除；所述半乳糖相关基因包括GAL1、GAL7和GAL10中的至少一种。5.根据权利要求3所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述ERG20和CrtE基因融合过表达。6.根据权利要求3所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述过表达的基因均整合到酵母基因组中，且基因拷贝数≥1。7.根据权利要求6所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述虾青素合成相关基因的拷贝数≥2，且逐次整合到酵母基因组的不同位点。8.根据权利要求6所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述整合位点包括：YPL062w上游位点、ADE6下游位点、ERG9上游位点、GAL1/GAL10/GAL7基因位点、HO基因位点、HIT1下游位点和SNQ2下游位点中至少一种。9.根据权利要求3～8任一项所述的重组酵母菌株，其特征在于，其基因组整合有如下至少一个基因模块：T
NAT5
‑
ERG13
‑
P
GAL1
‑
P
GAL10
‑
ERG10
‑
T
SCW4
；P
GAL7
‑
tHMG1
‑
T
ALY2
；ΔP
ERG9
::T
ARA1
_T
ALY2
(RC)
‑
ERG19(RC)
‑
P
GAL7
(RC)_T
VMA2
(RC)__P
ERG1
‑
ERG9；T
VMA2
(RC)
‑
ERG12(RC)
‑
P
GAL10
(RC)
‑
P
GAL1
‑
ERG8
‑
T
IDP1
；Δ(T
ADE6
‑
T
ERG25
(RC))::T
RPS18B
_T
ALY2
(RC)
‑
tHMG1(RC)
‑
P
GAL1
(RC)
‑
P
GAL10
‑
IDI1
‑
T
SCW4
；T
SCW4
_P
GAL7
‑
ERG20
‑
CrtE
‑
T
NAT5
_T
RRP4
；
ΔGAL1,ΔGAL7,ΔGAL10::T
AYL2
(RC)
‑
tHMG1(RC)
‑
P
GAL7
(RC)；T
IDP1
(RC)
‑
CrtI(RC)
‑
P
GAL10
(RC)
‑
P
GAL1
‑
CrtYB
‑
T
VMA2；
T
NAT5
(RC)
‑
CrtE(RC)
‑
P
GAL7
(RC)；T
HIT1
::T
IDP1
(RC)
‑
CrtI(RC)
‑
P
GAL7
(RC)；T
ALY2
(RC)
‑
CrtW(RC)
‑
P
GAL10
(RC)
‑
P
GAL1
‑
CrtZ
‑
T
SCW...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾薄轩，周慧，李东，刘慧敏，张骊，
申请(专利权)人：元一天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：