一种基于单细胞核转录组测序技术检测主动脉瓣膜破骨细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于单细胞核转录组测序技术检测主动脉瓣膜破骨细胞的方法，属于生物技术领域。步骤如下：收集主动脉瓣膜组织置于高糖培养基中保存，然后应用胶原酶工作液将组织裂解为单细胞悬液，随后采用细胞筛过滤非细胞成分，过滤后裂解细胞并分离细胞核，运用单细胞核转录组测序技术对细胞进行转录组检测。检测结果表明，相较于此前应用scRNA几乎没有捕获到瓣膜组织破骨细胞的结果，本方案在总共44000余个细胞核中捕获到了数千个可以被鉴定为破骨细胞或破骨细胞前体的细胞核，并获取了其平均测序深度为10X的转录组结果。此外，其他细胞的组成和比例均无显著变化，可说明该技术可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，尤其涉及一种基于单细胞核转录组测序技术检测主动脉瓣膜破骨细胞的方法。

技术介绍

1、心脏瓣膜病是影响人类健康的重大难治性疾病，全球约有2.09亿患者，瓣膜钙化是其核心病理损害，目前缺乏针对性防治策略。解析瓣膜钙化病理生理机制对防治钙化性心脏瓣膜病具有重要的意义。单细胞转录组测序技术(scrna)通过捕捉成千上万的异质细胞转录组，通过一次检测完整测定组织中全部细胞各自全部mrna的表达情况，分别展示在复杂组织中各种不同细胞的功能状态，使人们对疾病的认识有了很大的提高。在此前的研究中，许多研究者通过scrna技术解析人主动脉瓣膜细胞mrna水平并推断蛋白表达情况，并对主动脉瓣膜钙化的病理生理学机制进行了深入的解析。

2、破骨细胞在钙盐沉积，骨质形成与重塑方面具有重要作用。其聚集于钙盐沉积的核心附近，通过释放组织蛋白酶k等物质溶解钙盐并经由溶酶体吞噬吸收。在骨科的研究中，破骨细胞吸收并重塑异常钙化组织中起到了十分关键的作用，但是其在瓣膜钙化方面却缺乏深入的研究。其中一个重要的制约因素是当前对于主动脉瓣膜细胞在单细胞水平转录组检测技本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于单细胞核转录组测序技术检测主动脉瓣膜破骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中获取的主动脉瓣膜组织置于5mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium高糖培养基中。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中使用的胶原酶为I型胶原酶。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述I型胶原酶工作液制备方式为：以2mg/mL的浓度计算胶原酶用量，称取所需的胶原酶粉末溶解于Dulbecco’s ModifiedEagle Medium高糖培养基...

【技术特征摘要】

1.一种基于单细胞核转录组测序技术检测主动脉瓣膜破骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中获取的主动脉瓣膜组织置于5ml dulbecco’s modified eagle medium高糖培养基中。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中使用的胶原酶为i型胶原酶。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述i型胶原酶工作液制备方式为：以2mg/ml的浓度计算胶原酶用量，称取所需的胶原酶粉末溶解于dulbecco’s modifiedeagle medium高糖培养基，充分溶解，最后加入青霉素与链霉素的混合溶液，调整浓度使最后工作液中青霉素、链霉素两者浓度均为100iu/ml。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中裂解工艺参数为：把冲洗好的瓣膜转移至15ml离心管中，每管中加入8-10ml i型胶原酶工作液置于37℃恒温摇床中消化4-6小时，待瓣膜分解成絮状，提示消化裂解完成，随后以200-500g转速离心5-10分钟，吸弃上层液体，用0.2-0.5mol/l蔗糖溶液吹打重悬。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述每管中加入8ml i型胶原酶工作液，置于37℃恒...

【专利技术属性】
技术研发人员：李飞，徐力，郑一聃，钱兴宇，刘雨琦，董念国，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：