与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记ＢｏＲＡＡＧ／ＣＴＣ１１２及其获得方法技术

本发明专利技术公开了一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记ＢｏＲＡＡＧ／ＣＴＣ１１２及其获得方法。该分子标记为ＳＥＱ？ＩＤ？Ｎｏ．１的序列，长度共１９１ｂｐ。其获得方法如下：将结球甘蓝的抗病亲本‘Ｒ１０３’和感病亲本‘Ｓ１０１’杂交得到Ｆ１群体并构建相应的ＢＣ１、Ｆ２群体；明确该病害的病原是十字花科霜霉菌；进行抗病性调查发现在ＢＣ１、Ｆ２群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；利用ＡＦＬＰ分子标记技术及改良ＢＳＡ法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段的筛选，得到ＡＦＬＰ差异片段ＢｏＲＡＡＧ／ＣＴＣ并转化为ＳＣＡＲ标记ＢｏＲＡＡＧ／ＣＴＣ１１２，设计的引物为ＦＡＡＧ／ＣＴＣ１１２：５｀－ＡＴ？ＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＡＴＡＣＴＣＡＣ－３｀和ＲＡＡＧ／ＣＴＣ１１２：５｀－ＴＡＧＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＣＡＴＴＣＡＴ－３｀；该ＳＣＡＲ标记ＢｏＲＡＡＧ／ＣＴＣ１１２与抗性基因的遗传距离为５．７ｃＭ。该分子标记简单稳定，克服了常规育种方法周期长等缺点；可有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具稳定抗性的结球甘蓝品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记及其获得的方法，属于生物

技术介绍
结球甘蓝在世界各地普遍栽培，也是我国的主要蔬菜作物之一。甘蓝霜霉病是由 专性寄生菌寄生霜霉引起的一种世界性病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯 黄，导致产量降低，品质下降，给甘蓝生产上带来极大的损失。为解决上述的重大问题，挖掘 新的抗源，以往育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些 优良的抗霜霉病自交系，但在抗病育种和抗病转育过程中用传统的方法筛选抗性植株时选 育时间较长、操作程序繁琐；另一方面抗性易受环境条件的影响，难以适应育种实践需要。 近年来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助甘蓝抗病育种显出巨大潜力。 一类基于 DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于甘蓝抗病研究。应用分子标记技术， 可以免除传统育种中繁重的选择过程，而且跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗霜霉病基 因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。目前，国内外对结球甘蓝霜霉病的研究较少，迄 今还未有与结球甘蓝霜霉病抗性基因相连锁的分子标记的报道。因此，寻找与抗性基因紧 密连锁的稳定、简单的分子标记不仅可应用到分子辅助育种中，提高甘蓝抗病育种效率，在 农业上有重要的应用价值，而且还可以为进一步克隆相关的抗病基因并分析其功能奠定基 础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记B0RAAe/ CTC112 及其获得的方法。本专利技术实现其专利技术目的所采取的技术手段是该与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记B0RAAG/CTai2为SEQ ID No. 1的序列，序列的长度共191bp。 本专利技术所述的分子标记B0RAAe/CTai2的获得方法主要包括以下步骤 1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，将所述抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'进行杂交得到&群体，并构建相应的BQ、F2群体； 2)根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害 的病原是十字花科霜霉菌； 3)经过对BQ、&群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行抗病性调查发 现在所述BQ、 F2群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制； 4)利用AFLP分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差 异片段的筛选； 5)筛选出 一 个AFLP差异片段B0RAAe/CTC，将该AFLP差异片段B0RAAe/CTC转化为 SCAR标记BoR雄組n2，设计的引物为FMG/CTC112 :5—-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3—和RAAG/CTC112 : 5— -TAGAAAATTTGGACATTCAT-3—;经单株验证分析，该SCAR标记BoRAAe/CTai2与抗性基因的遗 传距离为5. 7cM。 本专利技术采用AFLP分子标记方法对结球甘蓝抗、感亲本及F2分离群体运用改良BSA 法构建的抗、感池进行抗霜霉病标记的筛选，然后将得到与结球甘蓝抗霜霉病相关的差异 片段，该片段实际长191 bp。将该片段转化为简单、稳定的SCAR标记BoRg^，同时，经 F2代群体160个单株的SCAR验证，利用Mapmaker/EXP3. 0软件进行分析，BoRMe/CTeil2标记 与抗病基因遗传连锁距离为5. 7cM。该标记可用于结球甘蓝抗霜霉病的辅助选择育种。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于 霜霉病是目前影响结球甘蓝生产的一种严重病害。本专利技术利用AFLP分子标记方 法，结合改良的BSA法得到一个与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段，并通过克隆、测 序、引物设计，将该片段转化成稳定简单的SCAR标记，可直接用于结球甘蓝抗霜霉病分子 标记的辅助选择育种。利用该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点， 还可以有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具有稳定抗性的结球甘蓝品种。同时也可 利用这个新霜霉病抗性基因的分子标记克隆抗霜霉病基因，并对其进行结构和功能分析， 这对于进一步了解结球甘蓝抗霜霉病的分子遗传机理有积极意义。因此，本专利技术在结球甘 蓝育种实践及抗病理论研究上均具有重要意义。附图说明 图1是结球甘蓝霜霉病菌图，该霜霉病菌为寄生霜霉(Hyaloperonospora); 图2是两个亲本和两对抗感池预扩产物1 %琼脂糖凝胶电泳图； 图3是AFLP特异条带的筛选及另一对池和亲本的验证谱带图； 图4是SCAR在两亲本、两对池、FpBQ中的分布谱带图； 图5是SCAR标记在抗病单株和感病单株中的分布谱带图； 图6是SCAR标记在30份材料中验证谱带图； 其中，图2-6中符号分别表示为 1.抗病亲本；2.感病亲本；3.第一抗病池；4.第一感病池；5.第二抗病池；6.第二感病池；7.Fi群体；8.感病亲本为回交亲本的BQ感病群体；9.感病亲本为回交亲本的BQ抗病群体；10.抗病亲本为回交亲本的BQ ; M :1000bp pUC mix marker ; R :有B0RMe/CTC112特异带的杂交后代抗病单株； R* :没有该特异带，但表型为抗病的杂交后代单株； S :没有B0RMe/CTC112特异带的杂交后代感病单株； S* :有该特异带的感病单株，表型为感病的杂交后代单株。具体实施例方式本专利技术与结球甘蓝抗霜霉病分子标记B0RMe/CTai2的获得方法主要包括以下步骤 (1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，4两者进行杂交得到巳群体，并构建了相应的BQ、 F2群体。根据田间发病材料的病害症状， 以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病原是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉)。利用田 间自然诱发抗性鉴定和苗期人工接种抗性鉴定，表明结球甘蓝对霜霉病的抗性受单基因显 性控制。 具体做法为对经多年选育的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'整 个生长过程中的霜霉病等病害发生情况进行调查，记载发病率、病情指数，并观察和描述症 状。采集'S101'的新鲜病叶，并进行处理，培养新生孢子囊产生后，制作临时镜检片，观察 病菌孢囊梗和孢子囊的形态特征。另用80% a-羟基丙酸浸泡田间病叶表皮组织，在150 倍显微镜下观察卵孢子形态特征，重复试验以明确病原。如图l所示说明孢子梗和孢子囊 的形态特征与十字花科寄生霜霉相一致。田间自然诱发抗性鉴定，采用五点法进行调查抗 病性，对'R103'、 'S101'、F2和BQ群体进行发病情况调查，调查级别分为免疫、高抗、抗病、 耐病、感病和高感，并随机镜检发病植株的病原菌。田间苗期人工接种鉴定，即在结球甘蓝 拉十字期，将从感病亲本材料上得到的病菌，并进行重新培养后，采用孢子悬浮液喷雾法接 种，接种7天后进行抗性调查。 (2)用AFLP分子标记方法，得到与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段B0RAAe/CTC。 具体做法是抗病亲本多代自交系'R103'为抗病基因供体，与多代自交系'S101' 感病材料进行杂交，并构建F2群体用于研究，用AFLP分子标记与改良BSA方法相结合得到 与结球甘蓝霜霉病相关的差异片段B0RAAC/CTC。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记ＢｏＲ↓［ＡＡＧ／ＣＴＣ１１２］，其特征在于：为ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１的序列，序列的长度共１９１ｂｐ。

【技术特征摘要】
一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112，其特征在于为SEQ ID No.1的序列，序列的长度共191bp。2. —种权利要求1所述的分子标记BoR皿/^^的获得方法，其特征在于包括以下步骤1) 利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，将所 述抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'进行杂交得到巳群体，并构建相应的BQ、F2群体；2) 根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病 原是十字花科霜霉菌；3) 经过对BQ、&群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：余小林，王神云，曹家树，李建斌，
申请(专利权)人：浙江大学，江苏省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]