【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学，尤其涉及一种提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用。
技术介绍
1、进入新世纪以来，体外诊断生物传感器发展迅猛，各种指标的生物传感器(如血糖、尿酸、胆固醇、乳酸等)在临床应用研究中取得突破性进展，而其中电化学生物传感器因具有重复性好、准确度高、测定范围广泛等优点，而受到科研工作者越来越多的关注。
2、现有已经成熟市场化的电化学试条多采用氧化酶体系，如血糖、尿酸、胆固醇等，基本是利用与之相对应的氧化酶来催化生物反应，然后利用铁氰化钾或亚铁氰化钾，亦或是其他电子介体传递反应过程中释放的电子到电极上，从而产生微电流完成检测，此反应体系制备的电化学传感器具有反应直接、原理明了、工艺简单的优点。但同时也有明显的缺点，比如血液样本的氧气含量会直接干扰测试的准确度，空气中的氧气也会使影响试条的稳定性和保存时间；另外，氧化酶体系的电化学反应在原理上不具有普适性，即并不是所有的氧化酶催化的生化反应中释放的电子都能够被转移到铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌化合物、有机染料这些常用的电子介体中去，也就没法形成能够被检测到的电化学信号，比如抗坏血酸氧化酶催化抗坏血酸的反应、胆红素氧化酶催化胆红素的反应等，都无法通过加入常用电子介体检测到可识别的电化学信号，需要对电子介体进行工作量极大的系统性筛查，才能找到合适的原理和方法来完成这一体系的检测。
3、与氧化酶体系相比，脱氢酶催化的生化反应大多需要辅酶或辅基的参与，虽然脱氢酶种类繁多，但辅酶或辅基却有极强的通用性，例如乳酸脱氢酶、3-羟丁酸脱氢
4、因此如果能够开发出一种测定辅酶浓度变化的电化学试条，就可以根据间接法计算出体系中相应脱氢酶活性及其底物浓度的变化。而又因为辅酶具有通用性，即使改变体系中的脱氢酶和底物种类，该原理和方法也同样适用。例如，在对nad/nadh实现有效的电化学检测方法后，就可以利用间接法测定其他同样以nad/nadh为辅酶的脱氢酶底物活性或底物浓度，如胆固醇脱氢酶活性和对应的胆固醇浓度、乳酸脱氢酶活性和对应的乳酸浓度等。
5、现阶段，已经有越来越多的科研工作者将目光聚焦在了脱氢酶体系的电化学生物传感器的市场化研究上，例如罗氏的血糖金电极试条，就采用fad为辅酶的葡萄糖脱氢酶为催化酶介，在提升抗干扰能力的同时，也较为明显的提升了试条的稳定性。还有目前市面上在售的雅培血酮电化学测试条同样采用脱氢酶体系，在辅酶nad的存在下，利用3-羟基丁酸脱氢酶催化底物，在底物完成反应的同时，令nad转化为nadh，然后再利用nadh转化到nad的过程中，将电子转移到电子介体中，从而实现可被检测到的电化学信号变化。可以预见的是，未来将会有越来越多的脱氢酶体系电化学测试条实现商业化。
6、但是，相较于氧化酶体系，脱氢酶作为生化反应的酶介也有很明显的缺点。因为大部分脱氢酶与辅酶的连接都很脆弱，在酶的提取和纯化过程中，辅酶极容易与酶发生分离。因此在实际使用过程中，只有极少数酶(如fad-gdh等)不需要额外加入辅酶或辅基，其他大部分均需要反应体系中加入nad、nadp、fmn或fad等，而这些辅酶稳定性较差，都需要保存在-20℃冰箱中，利用该体系检测的电化学试条保存时间和保存条件都有一定的限制。与氧化酶催化体系的电化学测试条相比，有明显的劣势。综上所述，具有针对性的提升辅酶在反应体系中的稳定性，对于提升试条的稳定性和保存时间，无疑具有巨大的裨益。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的技术问题，本专利技术提供一种提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用，本专利技术中的组合物能够有效提升nad/nadh的生物稳定性和反应体系整体的稳定性，且对于对于脱氢酶+nad反应原理下的体系具有一定的普适性。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/ml，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/ml。
4、在本专利技术中的环糊精是一种具有环形结构的有机高分子物质，其内环分布有一定数量的疏水基团，能够和nad/nadh上的疏水基团进行结合，而外环分布的基团则主要为亲水基团。这种特殊的空间结构可以让nad/nadh等生物有机小分子“镶嵌”入环糊精的内环中，然后再溶解到水溶液中，起到提升有机小分子溶解度的作用，同时这种特殊的包合结构，也能更好的保护nad/nadh等有机生物小分子的空间结构，让其具有更好的稳定性。本专利技术中的电子介体结合物能够更好的和电子介体(钌、铁氰化钾等金属离子)产生结合，从而提升电子传递效率，同时也能够与酶等生物大分子相结合，提供一定的保护作用。本专利技术中的聚乙烯吡咯烷酮是一种非离子型水溶性高分子化合物，具有胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，同时具有优异的溶解性能及生理相容性。在本专利技术中，聚乙烯吡咯烷酮能在试条的干燥过程中，于酶液表面形成一层具有保护作用的生物膜，保护内部具有活性的酶和环糊精-nad结合物分子结构不受破坏，从而保持酶和nad/nadh的生物活性。环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮三种组合使用，共同提高nad/nadh的生物稳定性。
5、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的组合物中，所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、2,6-二-o-甲基-β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种。
6、优选地，所述环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。
7、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的组合物中，所述电子介体结合物选自羧甲基壳聚糖、羧化壳聚糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素中的一种或多种。
8、优选地，所述电子介体结合物为羧甲基壳聚糖。
9、本专利技术中的羧甲基壳聚糖做为壳聚糖的衍生物，在具备壳聚糖良好的生物相容性、生物活性和生物可降解性的性能基础上，由于羧甲基的引入，使其还具备良好的水溶性和吸附性，其中尤其是对金属离子有着很强的吸附能力，因为分子结构中含有—oh、—nh2和—cooh等基团，而由于这些理化性质，使得羧甲基壳聚糖能够更好的和电子介体(钌、铁氰化钾等金属离子)产生结合，从而提升电子传递效率，同时壳聚糖也能够与酶等生物大分子相结合，提供一定的保护作用。
10、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的组合物中，所述聚乙烯吡咯烷酮选自聚乙烯吡咯烷酮6000、聚乙烯吡咯烷酮8000、聚乙烯吡咯烷酮10000中的一种或多种。
11、优选地，聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮8000。
12、基于相同的技术构思，本专利技术还本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/mL，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/mL。
2.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、2,6-二-O-甲基-β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述电子介体结合物选自羧甲基壳聚糖、羧化壳聚糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮选自聚乙烯吡咯烷酮6000、聚乙烯吡咯烷酮8000、聚乙烯吡咯烷酮10000中的一种或多种。
5.一种包含权利要求1-4任一所述的组合物的电化学试条。
6.根据权利要求5所述的电化学试条，其
7.根据权利要求5所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条的酶液中还包括NAD/NADH，所述NAD/NADH的浓度为2～15mg/mL。
8.根据权利要求5所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条中的脱氢酶选自3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶或乳酸脱氢酶中的一种。
9.根据权利要求8所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条的酶液中还包括酶保护剂、表面活性剂和缓冲液，所述酶保护剂为海藻糖和BSA，所述表面活性剂为TritonX-100，所述缓冲液选自HEPES、领苯二甲酸氢钾、MES、甘氨酸、Tris或CAPS中的一种。
10.如权利要求1-4任一所述的组合物在提高辅酶NAD/NADH生物稳定性中的应用。
11.如权利要求1-4任一所述的组合物或权利要求5-9任一所述的电化学试条在检测3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇或乳酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物，其特征在于，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/ml，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/ml。
2.根据权利要求1所述的提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物，其特征在于，所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、2,6-二-o-甲基-β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物，其特征在于，所述电子介体结合物选自羧甲基壳聚糖、羧化壳聚糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮选自聚乙烯吡咯烷酮6000、聚乙烯吡咯烷酮8000、聚乙烯吡咯烷酮10000中的一种或多种。
5.一种包含权利要求1-4任一所述的组合物的电化学试条。
6.根据权利要求5所述的电化学试...
【专利技术属性】
技术研发人员：史丙华，姜志华，汪江海，敖慧龙，
申请(专利权)人：湖南海源医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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