【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞外囊泡提取纯化方法，尤其涉及一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法。
技术介绍
1、外泌体和其他小的细胞外囊泡是越来越被广泛认可的生物颗粒。外泌体可以用于科研、诊断，化妆品及医药等领域。
2、外泌体的提取主要包括以下几种方法：
3、一、超速离心法。超速离心法是外泌体提取最常用的方法。该方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
4、二、过滤离心法。过滤离心法操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
5、三、密度梯度离心法。密度梯度离心法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
6、四、免疫磁珠法。免疫磁珠法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性ph和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
7、五、色谱法。色谱法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
8、六、微流控分离法。微流控分离法通过负压及震荡等机械原理分离外泌体，产量纯度均具有较大幅度提高，但需要特定设备配合。
9、中国专利技术专利申请cn114790439a公开了一种牛奶外泌体的制备方法，其提出了柠檬酸、磷酸钠沉淀法、edta沉淀蛋白法去除酪蛋白，并且提出硫酸铵去除酪蛋白方法，去除酪蛋白之后后续应用切向流超滤法实现其他杂蛋白的
技术实现思路
1、本专利技术的一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，以在分子筛层析前后通过两次中空纤维柱浓缩以得到高纯度外泌体。
2、本专利技术的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其通过edta溶液和醋酸钠缓冲液来处理牛奶以得到澄清液体，从而方便有效地去蛋白。
3、本专利技术的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其在分子筛层析后通过中空纤维柱和超滤柱浓缩以在保持较高浓度的外泌体同时去除杂蛋白提高外泌体纯度。
4、本专利技术的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其在超滤柱浓缩以后经过滤除菌步骤从而得到最终的牛奶外泌体产品。
5、本专利技术的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其中所述提取方法和纯化方法稳定、可靠。
6、本专利技术的其它优势和特点通过下述的详细说明得以充分体现并可通过所附权利要求中特地指出的手段和装置的组合得实现。
7、依本专利技术的一个方面，能够实现前述目的和其他目的的优势的一种牛奶外泌体提取纯化方法，包括以下步骤：
8、a)处理牛奶，得过滤液；
9、b)第一次浓缩：浓缩所述过滤液，其中用中空纤维柱对所述过滤液进行浓缩，以得到首次浓缩液；
10、c)分子筛层析：分子筛层析所述首次浓缩液，以得到层析液；
11、d)第二次浓缩：浓缩所述层析液，其中再次利用中空纤维柱对所述层析液进行浓缩，以得到再次浓缩液；
12、e)除菌。
13、根据本专利技术的一个实施例，其中在步骤b)和步骤d)中通过500kd中空纤维柱浓缩。
14、根据本专利技术的一个实施例，在步骤d)中，在通过500kd中空纤维柱再次浓缩以后，进一步使用100kd超滤柱浓缩。
15、根据本专利技术的一个实施例，步骤e通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
16、根据本专利技术的一个实施例，步骤a包括以下步骤：
17、a2)去脂，得乳清；
18、a3)澄清：处理所述乳清，得“透明状”液体。
19、a4)去蛋白：对所述“透明状”液体进行去蛋白处理；
20、a5)膜过滤。
21、根据本专利技术的一个实施例，所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤a进一步包括一步骤a1：在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶，其中步骤a1在步骤a2前进行。
22、根据本专利技术的一个实施例，步骤a3包括以下步骤：
23、a31)加入试剂一至所述乳清中，其中所述乳清和所述试剂一被混匀，从而得到黄色澄清液体；和
24、a32)加入试剂二至所述乳清中，所得混合液被缓慢颠倒混匀，直至固液分离并且液体部分为“透明状”；
25、其中所述试剂一是指0.25medta溶液，其中所述试剂二是指醋酸钠缓冲液。
26、根据本专利技术的一个实施例，所述试剂一的配置方法如下：称取36.53gedta粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gnaoh固体加入溶解，调节ph值至7.0，其中若ph值偏差太大，用hcl和naoh溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25medta溶液。
27、根据本专利技术的一个实施例，所述试剂二的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的ph值是4.0。
28、根据本专利技术的一个实施例，所述乳清与所述试剂一的体积比例为10:1，其中所述乳清与试剂二的体积比例≤10:1，其中10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”。
29、根据本专利技术的一个实施例，步骤c利用akta蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
30、根据本专利技术的一个实施例，步骤a1在25℃迅速解冻所述冻牛奶。
31、根据本专利技术的一个实施例，步骤a2的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心20min。
32、根据本专利技术的一个实施例，步骤a4的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心10min，取上清液，其中所述上清液用5mnaoh或nahco3调成中性。
33、根据本专利技术的一个实施例，步骤a5包括以下步骤：
34、a51)0.65μm膜抽滤；和
35、a52)0.22μm膜抽滤。
36、依本专利技术的另一个方面，本专利技术进一步提供一种牛奶外泌体，其粒径为150nm-160nm。
37、根据本专利技术的一个实施例，所述牛奶外泌体由以上牛奶外泌体提取纯化方法提取纯化得到。
38、根据本专利技术的一个优选实施例，所述牛奶外泌体的粒径为154。
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1.一种牛奶外泌体提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤D)后，还包括步骤E：通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
3.根据权利要求2所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤A进一步包括一步骤A1：在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶，其中步骤A1在步骤A2前进行。
5.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A3包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂一的配置方法如下：称取36.53gEDTA粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gNaOH固体加入溶解，调节pH值至7.0，其中若pH值偏差太大，用HCl和NaOH溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25MEDTA溶液。
7.根据权利要求6所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂二的配置方法如下：取醋酸钠
8.根据权利要求7所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述乳清与所述试剂一的体积比例为10:1，其中所述乳清与试剂二的体积比例≤10:1，其中10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤B)和步骤D)中通过500KD中空纤维柱浓缩。
10.根据权利要求9所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤D)中，在通过500KD中空纤维柱再次浓缩以后，进一步使用100KD超滤柱浓缩。
11.根据权利要求1-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤C利用AKTA蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
12.根据权利要求4所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A1在25℃迅速解冻所述冻牛奶。
13.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A2的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心20min。
14.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A4的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心10min，取上清液，其中所述上清液用5MNaOH或NaHCO3调成中性。
15.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A5包括以下步骤：
16.一种牛奶外泌体，其特征在于，所述牛奶外泌体的粒径为150nm-160nm。
17.根据权利要求14所述的牛奶外泌体，其中所述牛奶外泌体由权利要求1-8中任意一项所述牛奶外泌体提取纯化方法提取纯化得到。
...【技术特征摘要】
1.一种牛奶外泌体提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤d)后，还包括步骤e：通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
3.根据权利要求2所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤a包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤a进一步包括一步骤a1：在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶，其中步骤a1在步骤a2前进行。
5.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤a3包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂一的配置方法如下：称取36.53gedta粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gnaoh固体加入溶解，调节ph值至7.0，其中若ph值偏差太大，用hcl和naoh溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25medta溶液。
7.根据权利要求6所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂二的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的ph值是4.0。
8.根据权利要求7所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述乳清与所述试剂一的体积比例为10:1，其中所述乳清与试剂二的体积比例≤10:1，其中10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚楠，宣之胜，吴超，宋银萍，干嘉怡，S·阿曼妮，施戈韬，高博，
申请(专利权)人：苏州志恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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