【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种真菌漆酶突变体lcc5-g及其表达菌株和应用。
技术介绍
1、真菌漆酶(ec 1.10.3.2，ρ-二元酚氧化酶)属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。主要发生的是氧化还原反应，能够催化多种酚类与非酚类物质的氧化，使之生成相应的苯醌，同时伴随电子的转移，将分子还原成水，且反应过程无其它副产物生成。漆酶底物广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺类及其衍生物。漆酶在有毒化合物的生物消除、造纸工业、食品工业、生物燃料、生物传感器、工业染料脱色及木材工业中均有重要的应用价值。
2、黄曲霉毒素(aflatoxin，af)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物，是一种强毒性物质。af常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。af是一种剧毒物质，对人有极强的毒性，对肝脏有明显的损伤，可引起肝实质坏死、胆管上皮增生、肝脂肪浸润及肝出血等病变。af是一类强致癌物质，能使人体或动物的免疫功能丧失，而在所有af中，afb1的毒性最强，对人体的健康存在很大的健康隐患。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种真菌漆酶突变体lcc5-g及其表达菌株和应用。本专利技术以灰盖鬼伞(c.cinerea)的真菌漆酶lcc5为出发酶，通过分子对接、分子动力学模拟、以及蛋白与底物黄曲霉毒素结合的活性口袋相结合，获得单点突变基因。含有突变基因的工程菌诱导表达后，获得比酶活提高且稳定性提高的漆酶突变酶lcc5-g。以abts为底物时，突变体lcc5-g的比酶活提高了3
2、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g，是将漆酶氨基酸序列中第164位的甘氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
4、本专利技术突变基因，为含有如seq id no:2所述的漆酶突变体的编码基因。
5、本专利技术漆酶突变酶的表达菌株，含有所述突变基因。
6、本专利技术漆酶突变体的表达菌株，分类命名为pichiapastoris gs115/ppic9k(+)-lcc5-g，已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no：m 20232440，保藏时间为2023年12月04日，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。
7、本专利技术漆酶突变体的表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
8、以灰盖鬼伞(c.cinerea)的漆酶lcc5为出发酶，通过分子对接、分子动力学模拟、以及蛋白与底物黄曲霉毒素结合的活性口袋相结合，获得单点突变基因。根据分子对接(autodock)、分子动力学模拟(md)计算结果，选取位于漆酶cu2+附近距离内的氨基酸。再根据福井函数(fukui)计算黄曲霉毒素容易发生反应的原子位置。综合lcc5-afb1复合物的空间位置，确定突变体脱毒性能及稳定性可能提升的漆酶lcc5-g，确定突变氨基酸为164位的甘氨酸。pcr构建连入载体ppic9k，将线性化的质粒ppic9k电转化转入表达宿主毕赤酵母pichiapastoris gs115，经过md、bmm平板筛选后，得到含有本专利技术突变基因的工程菌株。
9、本专利技术漆酶突变体蛋白可由所述工程菌株发酵获得。
10、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g的应用，是将所述真菌漆酶突变体lcc5-g用于黄曲霉毒素的氧化转化。在ph7、45℃、150r/min的恒温水浴摇床反应12h。突变体lcc5-g氧化转化率为98％，出发酶lcc5的氧化转化为88％，突变体较出发酶氧化转化效率提升了。该突变体在氧化转化黄曲霉毒素中具有潜在的应用价值。
11、本专利技术对突变体蛋白和原始出发酶蛋白的比酶活、最适温度、稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示，以abts为底物时，突变体的比酶活提高了3倍。在此活力提高的同时，突变体的稳定性也得到了提高，在45℃、ph7.0下，突变体的半衰期提升了5倍。
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1.一种真菌漆酶突变体Lcc5-G，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
3.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的表达菌株，其特征在于：
4.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的应用，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种真菌漆酶突变体lcc5-g，其特征在于其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述真菌漆酶突变体lcc5-g的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如seqid no:2所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：张寅良，张蕾，张学成，房伟，肖亚中，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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