System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种真菌漆酶突变体Lcc5-G及其表达菌株和应用制造技术_技高网
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一种真菌漆酶突变体Lcc5-G及其表达菌株和应用制造技术

技术编号:41131532 阅读:4 留言:0更新日期:2024-04-30 18:01
本发明专利技术公开了一种真菌漆酶突变体Lcc5‑G及其表达菌株和应用。本发明专利技术以来自灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)异源表达的真菌漆酶为基础,通过定点突变,获得突变基因。含有突变质粒的真菌诱导表达后,获得比酶活、稳定性提升且脱AFB1效率提升的漆酶突变酶Lcc5‑G。以ABTS为底物时,突变体的比酶活提升了3倍,突变酶在45℃、pH7条件下稳定性提升至出发酶的5倍,该突变体在在氧化黄曲霉毒素中具有潜在应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物,具体涉及一种真菌漆酶突变体lcc5-g及其表达菌株和应用。


技术介绍

1、真菌漆酶(ec 1.10.3.2,ρ-二元酚氧化酶)属于铜蓝氧化酶,以单体糖蛋白的形式存在。主要发生的是氧化还原反应,能够催化多种酚类与非酚类物质的氧化,使之生成相应的苯醌,同时伴随电子的转移,将分子还原成水,且反应过程无其它副产物生成。漆酶底物广泛,包括酚类及其衍生物、芳胺类及其衍生物。漆酶在有毒化合物的生物消除、造纸工业、食品工业、生物燃料、生物传感器、工业染料脱色及木材工业中均有重要的应用价值。

2、黄曲霉毒素(aflatoxin,af)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,是一种强毒性物质。af常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。af是一种剧毒物质,对人有极强的毒性,对肝脏有明显的损伤,可引起肝实质坏死、胆管上皮增生、肝脂肪浸润及肝出血等病变。af是一类强致癌物质,能使人体或动物的免疫功能丧失,而在所有af中,afb1的毒性最强,对人体的健康存在很大的健康隐患。


技术实现思路

1、本专利技术提供了一种真菌漆酶突变体lcc5-g及其表达菌株和应用。本专利技术以灰盖鬼伞(c.cinerea)的真菌漆酶lcc5为出发酶,通过分子对接、分子动力学模拟、以及蛋白与底物黄曲霉毒素结合的活性口袋相结合,获得单点突变基因。含有突变基因的工程菌诱导表达后,获得比酶活提高且稳定性提高的漆酶突变酶lcc5-g。以abts为底物时,突变体lcc5-g的比酶活提高了3倍。在比酶活提高的同时,突变酶的半衰期在ph7、45℃的时候提升了5倍。该突变酶在氧化转化黄曲霉毒素中具有潜在应用价值。实验结果显示,同一条件下,突变酶氧化转化98%黄曲霉毒素,出发酶lcc5的氧化转化了88%的黄曲霉毒素。该突变体在黄曲霉毒素高效氧化转化方面有潜在应用价值。

2、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g,是将漆酶氨基酸序列中第164位的甘氨酸突变为谷氨酸,其氨基酸序列如seq id no:1所示。

3、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g的编码基因,其核苷酸序列如seq id no:2所示。

4、本专利技术突变基因,为含有如seq id no:2所述的漆酶突变体的编码基因。

5、本专利技术漆酶突变酶的表达菌株,含有所述突变基因。

6、本专利技术漆酶突变体的表达菌株,分类命名为pichiapastoris gs115/ppic9k(+)-lcc5-g,已送至中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为cctcc no:m 20232440,保藏时间为2023年12月04日,保藏地址:中国·武汉·武汉大学。

7、本专利技术漆酶突变体的表达菌株的构建方法,包括如下步骤:

8、以灰盖鬼伞(c.cinerea)的漆酶lcc5为出发酶,通过分子对接、分子动力学模拟、以及蛋白与底物黄曲霉毒素结合的活性口袋相结合,获得单点突变基因。根据分子对接(autodock)、分子动力学模拟(md)计算结果,选取位于漆酶cu2+附近距离内的氨基酸。再根据福井函数(fukui)计算黄曲霉毒素容易发生反应的原子位置。综合lcc5-afb1复合物的空间位置,确定突变体脱毒性能及稳定性可能提升的漆酶lcc5-g,确定突变氨基酸为164位的甘氨酸。pcr构建连入载体ppic9k,将线性化的质粒ppic9k电转化转入表达宿主毕赤酵母pichiapastoris gs115,经过md、bmm平板筛选后,得到含有本专利技术突变基因的工程菌株。

9、本专利技术漆酶突变体蛋白可由所述工程菌株发酵获得。

10、本专利技术真菌漆酶突变体lcc5-g的应用,是将所述真菌漆酶突变体lcc5-g用于黄曲霉毒素的氧化转化。在ph7、45℃、150r/min的恒温水浴摇床反应12h。突变体lcc5-g氧化转化率为98%,出发酶lcc5的氧化转化为88%,突变体较出发酶氧化转化效率提升了。该突变体在氧化转化黄曲霉毒素中具有潜在的应用价值。

11、本专利技术对突变体蛋白和原始出发酶蛋白的比酶活、最适温度、稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示,以abts为底物时,突变体的比酶活提高了3倍。在此活力提高的同时,突变体的稳定性也得到了提高,在45℃、ph7.0下,突变体的半衰期提升了5倍。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种真菌漆酶突变体Lcc5-G,其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的编码基因,其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

3.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的表达菌株,其特征在于:

4.权利要求1所述真菌漆酶突变体Lcc5-G的应用,其特征在于:

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:

【技术特征摘要】

1.一种真菌漆酶突变体lcc5-g,其特征在于其氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述真菌漆酶突变体lcc5-g的编码基因,其特征在于其核苷酸序列如seqid no:2所示。

【专利技术属性】
技术研发人员:张寅良张蕾张学成房伟肖亚中
申请(专利权)人:安徽大学
类型:发明
国别省市:

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