【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养及组织工程领域，涉及一种仿生纸基水凝胶喷涂膜、制备方法及应用。
技术介绍
1、在脉管系统中，内皮细胞形成了一个连续的、半透性屏障，将血液与周围组织分隔开来，从而控制血液与组织间物质交换以维持体内平衡。上皮细胞则构成哺乳动物外腔的保护层，两者都是通过特殊的紧密连接(tight junction)或闭锁小带(zonula occludens)形成具有选择性和渗透性的细胞屏障，其完整性对组织的生理功能和体内平衡至关重要。不同器官之间以及同一器官的不同血管区段之间的屏障紧密程度不同。例如，构成中枢神经系统(cns)血脑屏障(bbb)的内皮细胞具有高度特化的屏障特性，与体内任何其他内皮屏障相比，其渗透性不同。另外，在疾病状态下，保护人体重要器官的细胞屏障的完整性往往受到干扰，例如，在肿瘤细胞内渗和外渗的转移过程中，观察到物理重塑和内皮细胞屏障的破坏，渗透性增加，这是与癌症转移相关的关键步骤。
2、因此，体外构建细胞屏障对了解内皮和上皮屏障功能在生理和病理情况下潜在机制方面具有重要价值，同时，这些模型在推进治疗药物跨越细胞屏障到达靶点方面具有巨大的潜力。
3、现有的构建细胞屏障模型技术，多采用塑料或弹性树脂，如聚酯(pet)、聚碳酸酯(pc)聚二甲基硅氧烷(pdms)膜作为上皮或内皮细胞的支撑膜，由于此类材料与基底膜天然组成成分(胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白等)相去甚远，因此其生物力学性能、通透性及复杂的细胞-细胞和细胞-基质间三维微环境都无法模拟天然生理屏障。
技术
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种仿生纸基水凝胶喷涂膜、制备方法及应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种纸基表面的水凝胶喷涂膜，包括水凝胶层和纸基纤维支架。所述水凝胶层为具有光固化特性的甲基丙烯酸化水凝胶gelma，纸基纤维支架为whatman 105擦镜纸，厚度为20-25μm。gelma具有良好的成型性能和与细胞外基质相似的组成成分，尽可能模拟体内基底膜的组成。whatman 105擦镜纸具有超薄，高孔隙率，均匀纤维宽度和孔径的特点。由于纸基材料自身的纤维性、多孔性和柔韧性，使其具有模拟天然细胞微环境固有的三维结构，这种三维细胞培养系统可以产生与生理相关的流体流动、氧气和营养梯度。
4、一种纸基表面的水凝胶喷涂膜的制备方法，采用牺牲模板法，并通过喷涂的方式在纸基支架表层构筑一层厚度为1-2μm仿生基底膜。步骤如下：
5、步骤一：将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液按照比例依次滴加于纸基支架中，待其交联形成海藻酸钙后，作为牺牲模板。所述的海藻酸钠溶液浓度为5％-6％(w/v)，氯化钙溶液浓度为5％-6％(w/v)，两者混合滴加比例为1:1。
6、步骤二：在室温下将稀释后gelma水凝胶溶液均匀喷涂在含有牺牲模板的纸基表面，并进行光交联。再将纸基膜片放置在含有乙二胺四乙酸二钠盐溶液中去除牺牲模板，恢复纸纤维支架功能。gelma水凝胶溶液喷涂浓度为5％-15％(w/v)，紫外光致交联的工作参数(波长：395nm，照射时间：30s)。除去牺牲模板用乙二胺四乙酸二钠盐溶液的浓度为3％-5％；喷涂的工艺参数为：电压10-25kv，温度25-40℃，湿度20％-40％，喷嘴至纸基表面距离为6-10cm。
7、步骤三：最后，gelma水凝胶风干成膜。gelma水凝胶风干条件为20℃-30℃，相对湿度低于50％环境中，自然脱水风干。
8、进一步，将纸基gelma水凝胶膜牢固粘贴在24孔的transwell吊篮底部用于构建内皮或上皮细胞屏障。
9、进一步，利用鼠脑微血管内皮细胞株(bend.3)接种于纸基gelma水凝胶膜表面形成脑血管内皮屏障。将小鼠小胶质细胞株(n9)接种于三维纸基支架中，模拟天然血脑屏障的三维微环境。
10、进一步，所述的脑微血管内皮细胞株(bend.3)接种密度为2×105cell/cm2，培养条件为37℃，5％ co2环境下，在dmem培养基中培养2-3天,(培养基、温度湿度，长满培养时间)
11、进一步，将transwell倒置，使用matrigel对纤维层进行薄层包被，而后将所述小鼠小胶质细胞株(n9)以6×105cell/cm2的接种密度接种在纤维层，37℃，5％ co2环境下，在dmem培养基中培养4-5h，待其贴壁后，翻转transwell，加入培养基37℃，5％ co2环境下孵育。
12、本专利技术用于培养细胞时可增加细胞-基质间的相互作用，以及细胞的三维共培养，更加接近体内细胞生长微环境。在组织工程，体外模型构建中具有广阔的应用前景。本专利技术只使用gelma作为粘合剂，全过程不加入任何其它胶粘剂，以保证细胞相容性。方法简便，原料易得。
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1.一种纸基表面的水凝胶喷涂膜，包括水凝胶层和纸基纤维支架；所述水凝胶层为具有光固化特性的甲基丙烯酸化水凝胶GelMA，纸基纤维支架为Whatman 105擦镜纸，厚度为20-25μm。
2.权利要求1所述纸基表面的水凝胶喷涂膜的制备方法，其特征在于，采用牺牲模板法，并通过喷涂的方式在纸基支架表层构筑一层厚度为1-2μm仿生基底膜；步骤如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将纸基GelMA水凝胶膜牢固粘贴在24孔的Transwell吊篮底部用于构建内皮或上皮细胞屏障。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，利用鼠脑微血管内皮细胞株(bEnd.3)接种于纸基GelMA水凝胶膜表面形成脑血管内皮屏障；将小鼠小胶质细胞株(N9)接种于三维纸基支架中，模拟天然血脑屏障的三维微环境。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的脑微血管内皮细胞株(bEnd.3)接种密度为2×105cell/cm2，培养条件为37℃，5％CO2环境下，在DMEM培养基中培养2-3天。
6.根据权利要求2所述的制备方法
7.权利要求1所述纸基表面的水凝胶喷涂膜粘附于Transwell吊篮底部用于细胞培养，其特征在于，将已制备GelMA-Paper膜放置在紫外超净台中，打开紫外灯照射2-3h灭菌，然后称取0.1g GelMA冻干材料，加入光引发剂溶液配制成5％-15％的GelMA溶液作为粘合剂，将已灭菌的GelMA-Paper膜片使用上述粘合剂与Transwell吊篮粘合(GelMA面朝上)，使用395nm紫外灯照射30s使粘合剂固化以达到粘合效果。
8.将脑微血管内皮细胞(bEnd.3)接种权利要求1所述纸基表面的水凝胶喷涂膜表面，构建脑微血管内皮屏障，其特征在于，将上述Transwell吊篮放置在24孔板中，并在上下腔室中分别加入200μL和500μL培养基，37℃复水2-3h。然后使用胰酶将bEnd.3细胞从T75培养瓶上消化下来，离心后，进行重悬计数；将2×105cells/mL细胞悬液加入到Transwell上腔室中，37℃，5％CO2条件下孵育48h。
...【技术特征摘要】
1.一种纸基表面的水凝胶喷涂膜，包括水凝胶层和纸基纤维支架；所述水凝胶层为具有光固化特性的甲基丙烯酸化水凝胶gelma，纸基纤维支架为whatman 105擦镜纸，厚度为20-25μm。
2.权利要求1所述纸基表面的水凝胶喷涂膜的制备方法，其特征在于，采用牺牲模板法，并通过喷涂的方式在纸基支架表层构筑一层厚度为1-2μm仿生基底膜；步骤如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将纸基gelma水凝胶膜牢固粘贴在24孔的transwell吊篮底部用于构建内皮或上皮细胞屏障。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，利用鼠脑微血管内皮细胞株(bend.3)接种于纸基gelma水凝胶膜表面形成脑血管内皮屏障；将小鼠小胶质细胞株(n9)接种于三维纸基支架中，模拟天然血脑屏障的三维微环境。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的脑微血管内皮细胞株(bend.3)接种密度为2×105cell/cm2，培养条件为37℃，5％co2环境下，在dmem培养基中培养2-3天。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将transwell倒置，使用matrigel对纤维层进行薄层包被，而后将所述小鼠小...
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