【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物角膜制备领域，具体涉及一种表面抗黏脱细胞生物角膜及其制备方法和应用。
技术介绍
1、角膜是一种高度透明的组织，承担眼球屈光功能的三分之二，并作为屏障保护眼球不受机械和紫外损伤，阻挡外界异物。目前，角膜移植是临床治疗严重角膜损伤的唯一方案。角膜移植主要包括全层替换的穿透性角膜移植和仅替换上皮层和基质层的板层角膜移植。穿透性角膜移植是当前角膜移植的主要方式，成年人角膜内皮细胞不可再生，用于穿透性角膜移植的移植物必须带有健康的内皮层或具有类似内皮层的功能，以达到隔绝房水、维持角膜透明的功能。目前可用于穿透性角膜移植的角膜供体严重短缺，因此，临床开始使用人工制备的角膜材料来代替人来源同种异体角膜进行移植。已经商业化的角膜等价物主要分为以合成高分子为主要原料的人工角膜和以脱细胞猪角膜基质为主要原料的生物角膜两类。人工角膜包括波士顿型人工角膜、骨齿型人工角膜和alphacor人工角膜等，主要材料是聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)或聚甲基丙烯酸羟乙酯(phema)。这些材料呈生物惰性，无法实现宿主组织的生物整合，导致植入后脱出或并发症频发。且用于人工角膜手术移植流程复杂，每年实施的人工角膜移植病例十分有限。国内商品化的角膜替代物主要是以脱细胞角膜基质为原料的生物角膜。脱细胞角膜基质来源于猪角膜，通过一定的脱细胞方法去除免疫原性，保留角膜原有精细结构和活性物质，具有来源广泛、生物活性高、耐手术线缝合的优势，在角膜移植领域应用前景广阔。目前常用的几种脱细胞方法包括使用酶试剂、洗涤剂以及高低渗溶液中的一种或几种，但是这些方法都存在一定
2、中国专利申请202310156644.9公布了一种人工晶体及其制备方法，将聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯和疏水型丙烯酸酯等人工晶体材料等离子体处理后，将亲水抗污的聚合物或多肽共价键接到人工晶体表面，使其具有良好的亲水性和抗污性，长效抵抗蛋白以及细菌等污染物在晶状体表面粘附，提高人工晶体植入的稳定性和有效性。该专利中使用的人工晶体材料是合成高分子材料，不具有生物活性，且仅用于人工晶体植入，不适用于角膜移植领域。现有技术通常存在以下缺点：商品化人工角膜主要使用合成材料，生物相容性差，植入后容易引起青光眼、前房渗漏、眼内炎、视网膜脱落、眼压增高和角膜溶解等并发症，患者视力难以恢复；商品化人工角膜制备流程繁琐，手术流程复杂，难以应用推广；商品化生物角膜以脱细胞猪角膜基质为原料，其内表面与房水接触后，容易吸附蛋白，同时发生溶胀造成角膜水肿，导致透明度下降，无法直接接触房水。
3、相比较下，本专利技术提出的脱细胞角膜能够维持天然角膜的微观结构，保留大部分活性物质，更有利于细胞的黏附、增殖，免疫原性低、透明度高，抗蛋白黏附效果佳，在穿透性角膜移植方面具有突出优势。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种经化学改性处理的单面抗蛋白黏附、抗生物膜形成的脱细胞生物角膜及其制备方法。该脱细胞生物角膜来源于哺乳动物的眼球，来源广泛、易于获取。脱细胞方法温和，能够大程度保留天然角膜微观结构，维持角膜高透明度。相比于以合成高分子材料制备的人工角膜，脱细胞猪角膜保留眼球中蛋白质、多糖和生长因子等活性物质，能够更好模拟天然角膜微环境，为角膜上皮细胞、基质细胞等提供更多附着位点，保证细胞黏附、生长和繁殖，促进组织的再生与恢复。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、本专利技术第一方面提供了一种脱细胞生物角膜，所述角膜一侧表面化学修饰两性离子聚合物，所述两性离子聚合物在角膜表面形成聚合物分子刷；所述聚合物分子刷由两性离子单体或具有两性离子基团的聚合物在脱细胞生物角膜表面通过反应制备而成；
4、所述两性离子单体包括甲基丙烯酰氧乙基磺基甜菜碱(cas号:3637-26-1)、甲基丙烯酰乙基羧酸甜菜碱(cas号：24249-95-4)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(cas号：67881-98-5)、三甲铵和磺酸盐混合物中的至少一种。
5、优选地，所述聚合物分子刷由两性离子单体在脱细胞生物角膜表面通过反应制备而成；所述两性离子单体为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱。
6、本专利技术第二方面提供了一种所述的脱细胞生物角膜的制备方法，包括以下步骤：
7、将脱细胞角膜基质浸泡到丙烯酸酐类化合物溶液中，激活脱细胞角膜中活性反应基团与烯酸酐类化合物反应，反应后洗涤，使用掩膜覆盖一侧表面，然后浸泡在含两性离子基团的反应溶液中，引发脱细胞角膜基质另一侧表面的接枝反应，反应后洗涤，浸泡在去离子水中，得到所述的脱细胞生物角膜；
8、所述丙烯酸酐类化合物溶液包括甲基丙烯酸酐的水溶液；
9、所述含两性离子基团的反应溶液中含有两性离子单体或具有两性离子基团的聚合物，所述含两性离子基团的反应溶液中还含有引发剂。
10、通过修饰、交联一步法，在脱细胞角膜的内表面修饰两性离子聚合物，两性离子聚合物在角膜内表面形成超亲水性聚合物刷，该聚合物刷能够通过强静电相互作用在角膜内表面形成水化层，从而抵御泪液及房水中蛋白质黏附和生物膜的形成，维持角膜高透明度，防止角膜长期植入后，体内蛋白质吸附造成的透明度下降和生物污染等，解决了目前脱细胞角膜基质只能应用于板层角膜移植的问题。此外，该制备方法除了内表面对脱细胞角膜进行修饰，还对角膜基质结构进行交联，使得胶原纤维结构更加紧密，增强了脱细胞生物角膜的机械性能，同时不易吸水膨胀，有利于维持脱细胞生物角膜的透光性。该脱细胞角膜制备方法简便，易于操作，制备的脱细胞角膜透明度高，免疫原性低，生物相容性好，耐手术线缝合，能够直接与房水接触，有望用于穿透性角膜移植。
11、优选地，所述脱细胞角膜基质由包括以下步骤的制备方法制备得到：取动物眼球使用冲洗液冲洗；使用角膜刀剥削得到角膜切片；将角膜切片进行脱细胞处理，得到脱细胞角膜基质。进一步优选地，所述脱细胞处理包括以下步骤：将角膜切片浸泡在无菌pbs溶液中，震荡洗涤，然后浸泡在超纯水中，震荡洗涤；将角膜切片平铺，贴在离心管管壁上，冷冻，室温复温，重复2-8次；将角膜切片置于脱氧胆酸钠溶液中，在摇床中震荡洗涤；将角膜切片置于无菌pbs溶液中，震荡洗涤，得到脱细胞角膜基质。
12、优选地，所述动物眼球来自哺乳动物，所述哺乳动物包括人、猪、羊、牛、狗中的一种；进一步优选地，所述动物眼球为猪眼球。
13、优选地，所述丙烯酸酐类化合物溶液的浓度为0.5-10(v/v)％。
14、优选地，所述丙烯酸酐类化合物溶液的ph范围为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脱细胞生物角膜，其特征在于，所述角膜一侧表面化学修饰两性离子聚合物，所述两性离子聚合物在角膜表面形成聚合物分子刷；所述聚合物分子刷由两性离子单体或具有两性离子基团的聚合物在脱细胞生物角膜表面通过反应制备而成；
2.一种权利要求1所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述脱细胞角膜基质由包括以下步骤的制备方法制备得到：取动物眼球使用冲洗液冲洗；使用角膜刀剥削得到角膜切片；将角膜切片进行脱细胞处理，得到脱细胞角膜基质。
4.根据权利要求3所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述动物眼球来自哺乳动物，所述哺乳动物包括人、猪、羊、牛、狗中的一种。
5.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸酐类化合物溶液的浓度为0.5-10(v/v)％。
6.根据权利要求5所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸酐类化合物溶液的pH范围为5-9。
7.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方
8.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述引发剂为氧化还原引发剂、热引发剂、光引发剂中的一种；所述氧化还原引发剂包括过氧化二苯甲酰和N-N二甲苯胺混合物、过氧化二苯甲酰和N-N-二甲基-对甲苯胺混合物、过硫酸铵和亚硫酸氢钠混合物中的一种；所述热引发剂浓度包括过硫酸钾和/或偶氮二异丁基脒盐酸盐；所述光引发剂包括2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
9.根据权利要求8所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述引发剂为氧化还原引发剂时，所述含两性离子基团的反应溶液中氧化还原引发剂的浓度为0.01-0.5mol/L；所述引发剂为热引发剂时，所述含两性离子基团的反应溶液中热引发剂浓度为0.05-0.1mol/L；所述引发剂为光引发剂时，所述含两性离子基团的反应溶液中光引发剂浓度为0.05-0.1(v/v)％。
10.根据权利要求9所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述引发剂为氧化还原引发剂时，所述接枝反应温度为10-30℃，反应时间为0.5-24h；所述引发剂为热引发剂时，所述接枝反应温度为30-40℃，反应时间为0.2-2h；所述引发剂为光引发剂时，光照波长为290nm-450nm，光照强度为2-10mW/cm2，光照时间为40-120s。
...【技术特征摘要】
1.一种脱细胞生物角膜，其特征在于，所述角膜一侧表面化学修饰两性离子聚合物，所述两性离子聚合物在角膜表面形成聚合物分子刷；所述聚合物分子刷由两性离子单体或具有两性离子基团的聚合物在脱细胞生物角膜表面通过反应制备而成；
2.一种权利要求1所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述脱细胞角膜基质由包括以下步骤的制备方法制备得到：取动物眼球使用冲洗液冲洗；使用角膜刀剥削得到角膜切片；将角膜切片进行脱细胞处理，得到脱细胞角膜基质。
4.根据权利要求3所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述动物眼球来自哺乳动物，所述哺乳动物包括人、猪、羊、牛、狗中的一种。
5.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸酐类化合物溶液的浓度为0.5-10(v/v)％。
6.根据权利要求5所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸酐类化合物溶液的ph范围为5-9。
7.根据权利要求2所述的脱细胞生物角膜的制备方法，其特征在于，所述含两性离子基团的反应溶液中含有两性离子单体或具有两性离子基团的聚合物；所述两性离子单体的浓度为0.1-1mol/l。
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