【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种用于沙门氏菌检测的crrna、crisprcas12a系统及其应用。
技术介绍
1、沙门氏菌(s.aureus)被认为是最严重的传染性食源性病原体之一，在国际食品安全事件(efsa.2021)中，它几乎处于公共安全问题的首位或第二位，由于其侵袭性、毒力和抗生素耐药性，可导致严重的食物中毒。此外，随着抗生素在医药和农业中的滥用，细菌耐药性问题变得越来越严重。世界卫生组织将抗生素耐药性列为当前对全球健康、粮食安全和发展的威胁之一(who,2020)。
2、目前用于核酸检测的crispr蛋白有cas12a、cas12b、cas13a、cas13b、cas14以及csm6等。其检测原理基本相似，由cas蛋白与crrna结合形成crrna-cas蛋白复合体，当目标核酸分子存在时，可特异性性与目标核酸分子结合并激活cas蛋白的旁路核酸切割活性，任意切割荧光修饰报告探针。在这一过程中，cas蛋白的活性是由目标核酸(激活序列)激活的，目标核酸的浓度直接影响检测灵敏度。大量研究显示，在不经扩增的情况下，该方法只能检测到pm(10-9m)浓度级别的核酸。
3、基于cas12a的分子生物学诊断可以特异性检测核酸和生物标志物，可以用于准确鉴定致病菌中的基因型，包括毒力基因和耐药基因。但基于cas12a的方法仍然存在许多待解决问题：(1)在没有核酸预扩增的情况下，直接检测的灵敏度被限制在皮摩尔级和103cfu/ml的范围内，迄今为止报道的大多数基于crispr的平台通常与核酸目标的等温预扩增相结
4、设计对cas12a蛋白具有更好亲和力的替代dna报告物，从而能够提高灵敏度和反式裂解率，有可能显著提高检测灵敏度。与双链dna相比，短的单链dna探针具有更好的反式裂解活性，是最常用的报告探针。目前针对信号报告探针的研究较少，绝大部分的诊断检测仍然依赖于使用线性单链dna作为信号表达工具。然而，特定的dna二级结构(如发夹结构；环状结构；三联体等)的影响还没有被充分研究，不同的二级结构探针可以带来更低的背景荧光和更强终点荧光，改变信号输入与输出的相对变化之比(提高输入/输出函数的陡度)，提高检测灵敏度。
5、因此，一种快速、廉价且灵敏的沙门氏菌及其耐药菌的检测方法对于确保食品安全和人类健康至关重要。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种用于沙门氏菌检测的crrna、crispr cas12a系统及其应用，由于cas12a对发夹dna结构的亲和力(km)的改善，我们发现其反式切割活性的速度更快，与广泛使用的线性单链dna报道分子相比，使用发夹dna探针我们可以显著增强基于fitc的信号转导。能够在不存在上游预扩增步骤的情况下，通过改进的灵敏度和特异度，更快地检测相关的双链dna靶标。
2、第一方面：本专利技术提供了一种用于沙门氏菌检测的crrna，所述crrna的序列为seqid no.1-seq id no.8中任一所示。
3、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的用于沙门氏菌检测的crrna在制备制备沙门氏菌检测产品中的应用。
4、第三方面，本专利技术提供一种检测沙门氏菌的crispr cas12a系统，所述crisprcas12a系统包括权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crrna。
5、在一些实施方式中，所述crispr cas12a系统还包括：cas12a核酸酶和发夹探针，所述发夹探针的序列为seq id no.10-seq id no.16中任一所示。
6、第四方面，本专利技术提供一种基于crispr cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，该试剂盒中含有第三方面所述的检测沙门氏菌的crispr cas12a系统。
7、在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有非还原糖和甘露醇。
8、在一些实施方式中，非还原糖为非还原二糖或非还原多糖，例如蔗糖、普鲁兰糖等。
9、在一些实施方式中，试剂盒中，所述的检测沙门氏菌的crispr cas12a系统为冻干状态。
10、第五方面，本专利技术提供一种基于crispr cas12a系统快速检测沙门氏菌的方法，所述方法包括：利用第三方面所述的检测沙门氏菌的crispr cas12a系统对待测样品进行检测。
11、第六方面，本专利技术提供第三方面所述的检测沙门氏菌的crispr cas12a系统在制备沙门氏菌检测产品中的应用。
12、本专利技术相对于现有技术具有以下有益效果：
13、本专利技术基于crispr casl2a技术设计得到针对沙门氏菌的crrna，其中，seq idno.1-seq id no.8所示的crrna可以特异性的用于检测沙门氏菌。
14、本专利技术构建了基于发夹结构的fret信号转化探针，与广泛使用的线性单链dna报道分子相比，使用发夹dna探针可以显著增强基于fret的信号传导，实现无扩增检测。
15、本专利技术构建了冻干固定化的crispr casl2a体系，将操作流程从十多步缩短至四步，且本专利技术的冻干体系活力良好，保证了检测灵敏度。通过无扩增检测和固定化的crispr体系实现一步法检测，大幅度简化了基于cripsr检测方案的操作流程。
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1.一种用于沙门氏菌检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.8中任一所示。
2.权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crRNA在制备沙门氏菌检测产品中的应用。
3.一种检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统，其特征在于：所述CRISPR Cas12a系统包括权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crRNA。
4.如权利要求3所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统，其特征在于，所述CRISPRCas12a系统还包括：Cas12a核酸酶和发夹探针，所述发夹探针的序列为SEQ ID NO.10-SEQID NO.16中任一所示。
5.一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括有权利要求3-4中任一所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统。
6.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括非还原糖和甘露醇。
7.如权利要求
8.一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求3-4中任一所述的CRISPR Cas12a系统对待测样品进行检测。
9.权利要求3-4中任一所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统在制备沙门氏菌检测产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于沙门氏菌检测的crrna，其特征在于，所述crrna的序列为seq id no.1-seqid no.8中任一所示。
2.权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crrna在制备沙门氏菌检测产品中的应用。
3.一种检测沙门氏菌的crispr cas12a系统，其特征在于：所述crispr cas12a系统包括权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crrna。
4.如权利要求3所述的检测沙门氏菌的crispr cas12a系统，其特征在于，所述crisprcas12a系统还包括：cas12a核酸酶和发夹探针，所述发夹探针的序列为seq id no.10-seqid no.16中任一所示。
5.一种基于crispr cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：范明红，郑佳玉，孙秀兰，李红梅，周露，朱聿元，孙嘉笛，张银志，刘燕，戚培培，
申请(专利权)人：宝应县产品质量综合检验检测中心宝应县计量测试检定所，
类型：发明
国别省市：
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